姜油樹脂的超臨界CO2萃取條件及其抑菌活性

張魯明，王龍厚，陳雪香，藺萬煌

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

生姜(Zingiber officinaleRosco)為姜科多年生草本植物， 因其具有特殊的辛辣芳香氣味及活性功能成分，廣泛用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)[1,2]。超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，簡稱SFE)是近30年發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，由于其分離效果好，提取率高，產(chǎn)物無溶劑殘留，利于熱敏物質(zhì)萃取和產(chǎn)物的生物活性保留高的特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3-5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，生姜具有抗氧化、抑菌和降血脂等生理功效[6]。目前，山梨酸鉀作為一種國際公認(rèn)的常用食品防腐劑，雖然相對安全有效，但不是對所有細(xì)菌都有抑制效果，因此,尋求廣譜、高效、低毒、天然的防腐保鮮劑是目前食品科學(xué)研究中的熱點之一[7]。筆者對超臨界 CO2提取姜油樹脂的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對姜油樹脂的光、熱穩(wěn)定性和抑菌活性進(jìn)行了試驗，以期為生姜資源在天然防腐劑的開發(fā)利用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

生姜購于湖南長沙高橋蔬果批發(fā)市場，產(chǎn)地為山東。

試驗菌種大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella enterica)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)，均由武漢大學(xué)分子生物學(xué)基因工程藥物實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 姜油樹脂的萃取

將鮮姜洗凈，去掉腐爛和霉變部分，切成薄片，于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，用萬能粉碎機(jī)粉碎，密封干燥備用。每次取姜粉400 g裝入萃取釜中，試驗采用三因素三水平正交試驗設(shè)計(表1)，以萃取壓力、萃取溫度和萃取時間為自變量，以提取率為因變量，優(yōu)化提取工藝條件。

表1 超臨界CO2萃取姜油樹脂的因素和水平Table 1 Levels and factors with orthogonal experiment of ginger oleoresin supercritical CO2 fluid extraction

1.2.2 菌種的活化及懸菌液的制備

將所有供試細(xì)菌接種于LB斜面培養(yǎng)基上，放置于37℃培養(yǎng)箱中活化12 h。取活化好的菌株，用接種環(huán)挑取2環(huán)，放入裝有10 mL無菌水的試管中，振蕩幾分鐘，使菌種均勻分布于無菌水中，菌液中的細(xì)胞數(shù)約為106～107個/L。

1.2.3 姜油樹脂的抑菌試驗

采用濾紙片法測定不同濃度姜油樹脂的抑菌活性[8]。向平板培養(yǎng)基中加入200 μL已制備好的菌懸液，涂布均勻，用鑷子將滅菌后并分別浸透1，4，6，8，10 mg/mL姜油樹脂抑菌液且直徑為8 mm的濾紙片平鋪在培養(yǎng)基上，每處理設(shè)3次重復(fù)。另設(shè)1組2 mg/mL山梨酸鉀的陽性對照，無水丙酮溶液的陰性對照。所有平板于37℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈大小。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

按照 0.25，0.50，1.00，5.00，10.00 mg/mL 的質(zhì)量濃度梯度，配置姜油樹脂丙酮溶液。每種細(xì)菌按編號接1種濃度，每處理設(shè)3次重復(fù)。另設(shè)1組2 mg/mL山梨酸鉀的陽性對照，無水丙酮溶液的陰性對照。

1.2.5 姜油樹脂在不同時間紫外光照射處理后的抑菌試驗

將質(zhì)量濃度為4 mg/mL的姜油樹脂丙酮抑菌液放置在紫外光下，分別照射 10，30，60，120 min后，以未進(jìn)行紫外光照射的姜油樹脂丙酮抑菌液為對照，每處理3個重復(fù)，濾紙片法測定其抑菌效果。

1.2.6 姜油樹脂在不同溫度處理后的抑菌試驗

將質(zhì)量濃度為4 mg/mL姜油樹脂丙酮抑菌液分別在40，60，80，100，120 ℃下放置10 min，以未加熱的姜油樹脂丙酮抑菌液做對照，每處理3個重復(fù)，濾紙片法測定其抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜油樹脂萃取的優(yōu)化條件

由表2結(jié)果可見，姜油樹脂超臨界CO2萃取的最佳工藝條件為A2B2C3，即壓力22 MPa，溫度50℃，時間15 min，萃取率為5.38%。

表2 姜油樹脂萃取條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of ginger oleoresins extraction with SFE-CO2

2.2 姜油樹脂的濃度對抑菌效果的影響

從表3可以看出，不同質(zhì)量濃度的姜油對蘇云金桿菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有一定的抑制作用，隨著姜油濃度的增加，抑菌圈隨之增大。姜油樹脂對5種細(xì)菌的抑制效果為：蘇云金桿菌＞痢疾志賀菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞沙門氏菌。2.0 mg/mL山梨酸鉀的抑菌效果與 6 mg/mL姜油抑菌液的效果差異不顯著，但抑制效果顯著差于8.0 mg/mL和10.0 mg/mL的姜油抑菌液。

表3 不同質(zhì)量濃度姜油樹脂的抑菌作用Table 3 Bacteriostatic effect of different ginger oleoresin concentration

2.3 姜油樹脂的最小抑菌濃度(MIC)

由表4可以看出，姜油樹脂對大腸桿菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌及沙門氏菌的最低抑菌濃度分別為 1.0、0.5、1.0、0.5、1.0 mg/mL。

表4 姜油樹脂的最低抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of ginger oleoresin

2.4 不同時間紫外光照處理對姜油樹脂抑菌活性的影響

從圖5中可以看出，隨著光照時間的延長，姜油樹脂的抑菌效果逐漸降低，照射60 min后，其抑菌效果不再明顯下降。這表明，盡管光照對姜油樹脂的抑菌效果有一定的影響，但總體而言，姜油樹脂仍具有良好的光穩(wěn)定性。在紫外光照的照射下，仍能保持75%以上的抑菌效果。

圖5 光照時間對姜油樹脂抑菌活性的影響Fig.5 Effect of UV with different time on bacteriostatic activety of ginger oleoresin

2.5 不同溫度處理后姜油樹脂抑菌效果的變化

從圖6中可以看出，姜油樹脂的抑菌效果在溫度升到80℃時明顯下降，在溫度達(dá)到100℃時，下降幅度達(dá)到最大，之后隨著溫度的繼續(xù)升高，姜油樹脂的抑菌效果沒有明顯的變化，而其抑菌能力較未經(jīng)加熱處理的姜油，下降近40%，但仍然具有一定的抑菌能力，表明姜油樹脂具有一定的熱穩(wěn)定性。圖6 不同溫度處理對姜油樹脂抑菌效果的影響

Fig.6 Effect of ginger oleoresin with different temperature on bacteriostatic activity

3 結(jié)論與討論

超臨界CO2萃取姜油樹脂的最佳為壓力為22 MPa，溫度為50℃，時間為15 min，在此條件下萃取率可達(dá)5.38%。文獻(xiàn)[9]、[10]中超臨界CO2萃取姜油樹脂的萃取率分別達(dá)到4.75%和5.34%，本試驗得到的萃取率高于前者。文獻(xiàn)[11]中萃取姜油樹脂的最佳壓力為25 MPa，溫度為40℃，時間為2.5 h；文獻(xiàn)[12]中萃取姜油樹脂的最佳壓力為25 MPa，溫度為45℃，時間為120 min。本試驗中的萃取壓力要小，而萃取時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于文獻(xiàn)報道。在工業(yè)生產(chǎn)上，降低壓力可以節(jié)約生產(chǎn)成本，縮短時間可以提高生產(chǎn)效率。

姜油樹脂對大腸桿菌、痢疾志賀菌、蘇云金桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，其抑菌結(jié)果與文獻(xiàn)[13]、[14]的結(jié)果一致。本試驗的最低抑菌濃度均低于文獻(xiàn)[13]、[14]。6.0 mg/mL姜油樹脂的細(xì)菌抑制效果要優(yōu)于山梨酸鉀。

姜油樹脂經(jīng)過不同時間的紫外光照射和不同溫度處理后，抑菌活性仍保持在原有抑菌活性的75%和60%以上，表明姜油樹脂具有良好的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。安全、有效、低毒天然、綠色、安全的食品添加劑是目前熱門的研究課題，山梨酸鉀是目前被廣泛應(yīng)用的工業(yè)防腐劑，但其用量難以嚴(yán)格控制，過多的食用對人體損害較大，且穩(wěn)定性較差。姜油樹脂的抑菌作用非常明顯，且具有良好的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，對人體有益無害，作為食品添加劑，具有很好的應(yīng)用開發(fā)潛力。

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