黃芩苷對UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物生成的干預(yù)作用

吳迪，周炳榮，駱丹

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029）

黃芩苷對UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物生成的干預(yù)作用

吳迪，周炳榮，駱丹

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029）

目的 觀察中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物的形成情況，以及黃芩苷的干預(yù)作用。方法 將各種不同濃度的黃芩苷（0～250μg/mL）與人皮膚成纖維細(xì)胞共同孵育24h后，采用免疫組織化學(xué)法及免疫斑點印跡技術(shù)檢測30mJ/cm2UVB輻射及黃芩苷干預(yù)下，輻射后30min人皮膚成纖維細(xì)胞DNA內(nèi)環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）的產(chǎn)生情況。并采用紫外分光光度計法檢測黃芩苷在紫外波段的吸光度。結(jié)果 黃芩苷能在UVB輻射后30min內(nèi)減輕光產(chǎn)物的形成，其在UVA、UVB和UVC波段內(nèi)有較強(qiáng)的吸收紫外線能量的能力。結(jié)論 黃芩苷對UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物的形成有一定抑制作用。黃芩苷是一種有效的紫外線防護(hù)劑。

黃芩苷；環(huán)丁烷嘧啶二聚體；中波紫外線

日光中的中波紫外線（UVB）可以誘發(fā)紅斑和日曬傷，并與皮膚癌有關(guān)。UVB照射?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，特別是光加合物環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimmers,CPDs）的生成，如果修復(fù)不完善，即可導(dǎo)致DNA突變及皮膚癌的發(fā)生[1-5]。生物體有固有的切除和修復(fù)光產(chǎn)物的能力，這些生理性修復(fù)活動同時會受到外界因素，如藥物的影響。一些實驗已經(jīng)證實黃芩苷具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能拮抗UVB輻射所致的皮膚細(xì)胞因子分泌變化和光產(chǎn)物的清除[6-9]，但黃芩苷是否對經(jīng)過UVB輻射后的人皮膚成纖維細(xì)胞的光產(chǎn)物的形成有干預(yù)作用，尚未見報道。本實驗主要研究UVB照射后CPDs的生成情況以及黃芩苷對UVB輻射人皮膚成纖維細(xì)胞CPDs生成的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 黃芩苷（中國生物制品鑒定所）使用培養(yǎng)基配成濃度為10mg/mL的溶液備用；紫外線輻射儀（上海Sigma公司，并以配套的探測儀測定UVB劑量）；紫外-可見光譜儀（日本島津UV-2450）；CPDs一抗（美國Sigma生物科技公司）；免疫組化試劑盒 (博士德生物工程有限公司)；AEC顯色試劑盒（邁新生物科技公司）；全基因組DNA提取試劑盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 人皮膚成纖維細(xì)胞與細(xì)胞爬片 原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，取8～12代細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，以每孔106個細(xì)胞接種于含無菌蓋玻片的6孔板，細(xì)胞90%融合時輻射UVB。

1.3 實驗分組及處理 將人皮膚成纖維細(xì)胞分為對照組、UVB輻射組和UVB＋黃芩苷組。對照組細(xì)胞分別為未經(jīng)處理和經(jīng)250μg/mL黃芩苷處理組；UVB輻射組細(xì)胞經(jīng)過30mJ/cm2UVB輻射；UVB＋黃芩苷組細(xì)胞分別經(jīng)過 50、100、150、200、250μg/mL處理24h后接受30mJ/cm2UVB輻射。各組輻射組細(xì)胞在輻射后30min進(jìn)行如下檢測。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測CPDs 將細(xì)胞爬片用10%中性緩沖福爾馬林固定4h以上，封閉非特異性抗原后，滴加用PBS適當(dāng)稀釋的一抗（小鼠抗人CPDs IgG單抗稀釋1 000倍），37℃孵育1h后，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min后滴加試劑SABC，37℃孵育20min后以AEC顯色：使用AEC顯色試劑盒室溫顯色后顯微鏡觀察。細(xì)胞核中有紅色顆粒者為CPDs陽性細(xì)胞。

1.5 免疫斑點印跡法檢測CPDs 按照全基因組DNA提取試劑盒說明書，按一般步驟提取細(xì)胞DNA，將之使用加樣器點于帶正電的硝酸纖維素膜上，封閉非特異性抗原后，用PBS適當(dāng)稀釋的一抗（小鼠抗人CPDs IgG單抗稀釋1 000倍）37℃孵育1h后，加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(稀釋1 000倍)37℃孵育1h后，經(jīng)相應(yīng)底物顯色后，凝膠成像掃描系統(tǒng)處理后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 紫外-可見光譜測定 參照文獻(xiàn)[10]。取0.1mg黃芩苷溶于10mL甲醇，調(diào)節(jié)溶液濃度，使200～500nm之間的最大吸收峰的吸光度A值在0.1～O.5之間。取制備的樣品2～3mL，在200～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用單因素方差分析，組間比較用LSD法，數(shù)據(jù)用±s表示，數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS for Windows11.0統(tǒng)計軟件。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃芩苷對UVB輻射后人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物影響的形態(tài)學(xué)變化 在未處理組，人皮膚成纖維細(xì)胞無明顯陽性細(xì)胞核；陽性細(xì)胞只出現(xiàn)在經(jīng)過UVB輻射組中，在UVB輻射組中陽性細(xì)胞的數(shù)量和強(qiáng)度明顯多于UVB＋黃芩苷組。見圖1～3。

2.2 不同濃度的黃芩苷對UVB輻射后人皮膚成纖維細(xì)胞光產(chǎn)物生成的影響 如圖4所示，在對照組無CPDs陽性信號；僅在經(jīng)過UVB輻射的細(xì)胞中出現(xiàn)CPDs陽性信號；以UVB輻射組平均信號強(qiáng)度為100%計算，在UVB＋黃芩苷組中，經(jīng)過濃度為50、100、150、200、250μg/mL 的黃芩苷的處理的細(xì)胞的CPDs的信號強(qiáng)度分別為（98.23±6.25）%、（93.44±5.12）%、（78.19±7.35）%、（45.45±6.32）%和（21.14±9.03）%。與UVB組相比，當(dāng)黃芩苷的濃度大于150μg/mL時，信號強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

2.3 黃芩苷的紫外-可見光譜 如圖5中所示，黃芩苷的甲醇溶液紫外光譜在200～400nm區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了4個強(qiáng)吸收峰，吸收波長分別為204nm、214.80nm、277.20nm和316.6nm。強(qiáng)吸收峰分別分布于UVA、UVB和UVC波長范圍內(nèi)。

3 討論

日光中的紫外線輻射（UVR）是引起皮膚炎癥、日曬傷、日光性皮膚病、光老化及皮膚癌的主要環(huán)境因素[1，2]。其中UVB的生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)度是UVA的800～1 000倍，是引起皮膚急慢性損害和光致癌的最重要波段。在光致癌過程中細(xì)胞DNA是紫外線的主要靶分子，UVB輻射可引起多種DNA損傷，其中最主要的是形成特征性光產(chǎn)物環(huán)丁烷嘧啶二聚體CPDs和6-4PPs[3]。一般認(rèn)為CPDs比6-4PPs更致癌，形成的量是其3倍且修復(fù)效率也低于后者。兩種損傷都能導(dǎo)致基因突變?nèi)鏑→T或CC→TT轉(zhuǎn)換，即紫外線誘導(dǎo)的突變。CPDs被認(rèn)為是UVB誘導(dǎo)皮膚癌的重要介質(zhì)[4，5]。

中藥黃芩含有豐富的黃酮類化合物，其中主要活性成分是黃芩苷，黃芩苷具有廣泛的藥理作用。黃芩苷對UV有很強(qiáng)的吸收能力，吸收范圍廣，是無毒、無害、優(yōu)良的天然紫外線吸收劑[11]?，F(xiàn)代藥理實驗證實黃芩苷有抗變態(tài)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基等藥理作用[12-15]。本研究小組的一些實驗結(jié)果也已經(jīng)證實黃芩苷能拮抗UVB輻射所致的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞突變增加和光產(chǎn)物的清除[6-9]。為本實驗的開展提供了先期基礎(chǔ)和依據(jù)。

本實驗采用免疫組織化學(xué)法和免疫斑點印跡法檢測UVB輻射及黃芩苷處理后對人皮膚成纖維細(xì)胞CPDs的產(chǎn)生情況。免疫組化結(jié)果顯示：非照光組未見陽性細(xì)胞，即無CPDs形成；各個UVB輻射組有CPDs產(chǎn)生及細(xì)胞DNA損傷，可檢測到陽性細(xì)胞（見圖1～3）。一般認(rèn)為在UVB輻射后細(xì)胞在即時開始產(chǎn)生CPDs，30min內(nèi)達(dá)到高峰，在本實驗中我們從免疫斑點印跡法結(jié)果中觀察到UVB+黃芩苷實驗組中，當(dāng)黃芩苷的濃度大于150μg/mL時CPDs的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低。筆者認(rèn)為此結(jié)果證實了黃芩苷的光保護(hù)作用，尤其對人皮膚細(xì)胞的DNA有明顯的保護(hù)作用，此外從圖3中我們也可以看到黃芩苷可以在各個紫外波段內(nèi)出現(xiàn)吸收峰值，并且在UVB波長范圍中有較強(qiáng)的UV吸收能力，由此可以部分解釋黃芩苷減少CPDs產(chǎn)生的原因。但結(jié)合本研究小組既往的研究成果，還不能據(jù)此就認(rèn)為黃芩苷在光保護(hù)作用中發(fā)揮的僅是紫外線吸收劑的作用，因為我們發(fā)現(xiàn)在外用黃芩苷的野生型小鼠皮膚受到UVB輻射后，其CPDs的產(chǎn)生受到抑制，但清除過程也大大加快[9]；此外，茶多酚單體（EGCG）和黃芩苷一樣屬于黃酮類抗氧化劑，在既往研究中也發(fā)現(xiàn)有光保護(hù)作用[16]，但在黑素細(xì)胞經(jīng)過200μg/mL EGCG處理24h后接受UVB輻射，其CPDs的生成卻沒有明顯改變[17]。我們推測黃芩苷抑制光產(chǎn)物形成的作用還與之其他一些特性相關(guān)。

總之，在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對UVB誘導(dǎo)光產(chǎn)物的形成有防護(hù)作用，由此提示黃芩苷可能是一種有效的紫外線防護(hù)劑，但其作用的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

［1］Honigsmann H.Erythema and pigmentation[J].PhotodermatolPhotoimmunol Photomed,2002,18:75-81.

［2］ Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138:1462-1470.

［3］Ravanat JL,Douki T,Cadet J.Direct and indirect effects ofUVradiation on DNAand its components[J].J PhotochemPhotobiol B,2001,63:88-102.

［4］Matsumura Y,Ananthaswamy HN.Molecular mechanisms of photocarcinogenesis[J].Front Biosci,2002,7:765-783.

［5］ Basílico G,Roger CA,Seigelchifer M,et al.UV-specific DNA repair recombinant fusion enzyme:a new stable pharmacologically active principle suitable for photoprotection[J].J Dermatol Sci,2005,39:81-88.

［6］明亞玲，駱丹，徐晶，等.茶多酚單體和黃芩苷對紫外線輻射皮膚成纖維細(xì)胞的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué),2005,14(5):541-544.

［7］駱丹，林向飛，吳迪，等.黃芩甙對中波紫外線照射HaCaT細(xì)胞后光產(chǎn)物的影響[J].中華皮膚科雜志，2006，39(2):98-101.

［8］閔瑋，駱丹，林向飛.黃芩對皮膚細(xì)胞紫外線損傷的保護(hù)作用[J].徐州醫(yī)學(xué)院院報，2004，24(2)：167-170.

［9］Bing-Rong Z,Song-Liang J,Xiao-E C,et al.Protective effect of the Baicalin against DNA damage induced by ultraviolet B irradiation to mouse epidermis[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2008,24:175-182.

［10］李云霞，索全伶，賀文智，等.黃芩有效成分的紫外-可見吸收光譜表征[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（1）：131-134.

［11］劉產(chǎn)明.用黃芩甙作紫外光吸收試劑多效防曬液 [J].中草藥,1990,12（9）:10-11.

［12］張永欽，周井炎，徐輝碧.黃芩甙的抗氧化作用[J].華中理工大學(xué)學(xué)報，1999，27（4）:110-112.

［13］侯艷寧，朱秀媛，程桂芳.黃芩苷的抗炎機(jī)理[J].藥學(xué)學(xué)報，2000，35（3）:161-164.

［14］張喜平，田華，程琪輝.黃芩苷的藥理作用研究現(xiàn)狀[J].中國藥理學(xué)通報，2003，19（11）:1212-1215.

［15］Miocinovic R,McCabe NP,Keck RW,et al.In vivoand vitro effect of baicalein on human prostate cancer cells[J].Int J Oncol,2005,26:241-246.

［16］Katiyar SK.Skin photoprotection by green tea:antioxidant and immunomodulatoryeffects[J].CurrDrugTargetsImmuneEndocrMetabol Disord,2003,3:234-242.

［17］高潔，駱丹，周炳榮，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對中波紫外線誘導(dǎo)人原代表皮黑素細(xì)胞光損傷干預(yù)作用的研究[J].臨床皮膚科雜志，2008,7(6):345-347.

Inhibitory Effects of Baicalin on Formation of the Photoproduct in Human Skin Fibroblasts Induced by Ultraviolet B Light

WU Di,ZHOU Bing-rong,LUO Dan
First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Baicalin on formation of the photoproduct in human skin fibroblasts induced by ultraviolet B （UVB） light.MethodsHuman skin fibroblasts were incubated with various concentrations of Baicalin (0-250μg/mL)for 24 hours.Immunohistochemistry and immune dot blot test(IDBT)was used to detect cyclobutane pyrimidine dimmers(CPDs)in DNA of human skin fibroblasts 30 minutes after 30mJ/cm2UVB radiation and Baicalin intervention.The UV absorbance ability of Baicalin was detected by UV spectrophotometer.ResultsBaicalin could reduced CPDs formation 30 minutes after UVB radiation.Baicalin had a strong ability to absorb ultraviolet energy within UVA,UVB and UVC band.ConclusionBaicalin can inhibit the the formation of the photoproducts induced by UVB light in human skin fibroblasts.Baicalin is an effective UV protectant.

Baicalin;cyclobutane pyrimidine dimers;ultraviolet B

R285

A

1672－0709（2011）05-0273－03

國家自然科學(xué)基金項目(30771946及81000700)

駱丹，E-mail:daniluo2005@yahoo.com.cn

2011-05-15)