高效液相色譜法測(cè)定人血漿頭孢米諾鈉濃度

鄭厚林，陳陽建

(1.浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥劑科，315040;2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，寧波315100)

頭孢米諾鈉的含量測(cè)定方法多有報(bào)道[1-3]，但有關(guān)其血漿濃度測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道[4]并不多見，筆者在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了一種操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，并適用于臨床上頭孢米諾鈉血漿濃度的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究的反相高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器日本島津高效液相色譜儀，包括LC-10Advp型泵、SPD-10A型紫外檢測(cè)器和CTO-10AS型柱溫箱;N-3000色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程研究所)。WX-80A旋渦儀(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，AB204-A電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器公司)，PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠生產(chǎn))。

1.2 試藥頭孢米諾鈉對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):130508-200301，含量:77.4%)，阿司匹林對(duì)照品(沈陽萬隆制藥廠，批號(hào):20090318，含量:99.0%)，注射用頭孢米諾鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):090607，規(guī)格:每瓶1.0 g)，0.9%氯化鈉注射液(上海百特醫(yī)療用品有限公司，批號(hào):S0907103，規(guī)格:250 mL∶2.25 g)，甲醇為色譜純，冰醋酸、醋酸銨、高氯酸均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 頭孢米諾鈉對(duì)照品貯備液的配制精密稱取頭孢米諾鈉對(duì)照品129.2 mg置于100 mL容量瓶，加流動(dòng)相溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1頭孢米諾鈉對(duì)照品貯備液，并于4℃保存。臨用前用純化水稀釋至相應(yīng)濃度即可。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取阿司匹林對(duì)照品100 mg，置于100 mL容量瓶，加少量甲醇溶解，然后用流動(dòng)相稀釋定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)貯備液，并于4℃保存。準(zhǔn)確移取內(nèi)標(biāo)貯備液2.0 mL，置于10 mL量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即為200 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 色譜條件色譜柱:Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:20 mmol·L-1醋酸銨溶液(加冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm?？瞻籽獫{、血漿樣品和頭孢米諾鈉標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖1。

圖1 3種溶液高效液相色譜圖

由圖1可知，頭孢米諾鈉和內(nèi)標(biāo)色譜峰均不受血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，且兩者能夠完全分離，頭孢米諾鈉和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.7和6.9 min。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理取血漿400 μL，置于1.5 mL具塞離心管，分別加內(nèi)標(biāo)溶液100 μL和10%高氯酸溶液250μL，渦旋振蕩混勻2min，15 000 r·min-1離心8 min(離心半徑:6 cm)，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測(cè)限取空白血漿400 μL，加頭孢米諾鈉對(duì)照品貯備液適量，分別配制成0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0 μg·mL-1血漿樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)行色譜分析，以頭孢米諾鈉/內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對(duì)頭孢米諾鈉濃度(C)進(jìn)行加權(quán)(W=1/C2)線性回歸，上述各濃度對(duì)應(yīng)的Y值分別為0.081，0.132，0.315，0.533，1.192，2.881，5.823，11.023，22.718 μg·mL-1，得回歸方程為Y=0.021+0.113C(r=0.999 7，n=9)。結(jié)果表明，頭孢米諾鈉在0.5～200.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限0.5 μg·mL-1(S/N≥3)。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)取空白血漿400 μL，準(zhǔn)確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下操作，于同日內(nèi)及連續(xù)3 d測(cè)定，所得結(jié)果代入回歸方程，分別計(jì)算日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s

表1 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s

加入量/(μg·mL－1)日內(nèi)精密度測(cè)得量/(μg·mL－1)RSD/RSD/%日間精密度測(cè)得量/(μg·mL－1)%1.00.97±0.055.160.95±0.077.37 10.09.86±0.424.269.82±0.464.69 100.099.78±1.581.59100.42±2.362.36

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

2.6.1 提取回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)操作，所得峰面積(A1)與相應(yīng)濃度的頭孢米諾鈉對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積(A2)進(jìn)行比較。回收率(%)=A1/A2×100%，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表2。

2.6.2 方法回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確配制含頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)操作，以頭孢米諾鈉測(cè)得量與實(shí)際加入量的比值計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表2。平均提取回收率83.20%，RSD=3.35%;平均方法回收率98.51%，RSD=1.37%。

表2 頭孢米諾鈉回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %，±s，n=5

表2 頭孢米諾鈉回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %，±s，n=5

濃度/(μg·mL－1)提取回收率方法回收率1.080.1997.11 10.083.7498.63 100.085.6799.78

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取空白血漿400 μL，準(zhǔn)確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)操作，以最初的測(cè)量值為100%，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，分別考察血漿樣品在室溫放置2，24 h;血漿樣品于－20℃冷凍24 h后室溫下解凍并反復(fù)凍融3次;以及血漿樣品于－20℃冷凍30 d的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

表3 頭孢米諾鈉穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果μg·mL-1，±s

表3 頭孢米諾鈉穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果μg·mL-1，±s

濃度室溫2 h穩(wěn)定性室溫24 h穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性(反復(fù)凍融3次)長(zhǎng)期穩(wěn)定性(－20℃，30 d)1.01.01±0.040.97±0.060.87±0.050.94±0.05 10.09.90±0.389.86±0.549.58±0.619.78±0.47 100.0100.88±2.31100.32±3.4694.87±4.7998.38±3.86

3 討論

筆者在選擇流動(dòng)相時(shí)分別考察了20 mmol·L-1醋酸銨溶液與甲醇的比例以及流動(dòng)相的pH對(duì)色譜分離效果的影響，按不同配比均發(fā)現(xiàn)頭孢米諾鈉的峰拖尾，峰形不對(duì)稱，因此加入少量三乙胺。最終確定流動(dòng)相為20 mmol·L-1醋酸銨溶液(加冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5)，樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰、雜質(zhì)峰均可完全分離并且無拖尾現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10%高氯酸沉淀蛋白的效果明顯好于10%和20%的三氯乙酸，沉淀完全且雜質(zhì)較少，乙腈的血漿蛋白結(jié)合率相對(duì)較低且毒性較大，故選用10%高氯酸作為血漿樣品處理的蛋白沉淀劑。

在內(nèi)標(biāo)物的選擇上，曾參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，采用對(duì)乙酰氨基酚、鄰硝基苯甲酸和阿司匹林等作為內(nèi)標(biāo)，采用對(duì)乙酰氨基酚或鄰硝基苯甲酸的分離效果并不理想，且出峰時(shí)間較長(zhǎng)，阿司匹林作為內(nèi)標(biāo)物，能夠得到較好的分離效果，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾，且保留時(shí)間較短，縮短了分析周期，可提高樣品的測(cè)定效率。

[1]吳慶歡，陳彩云，伍俊妍，等.注射用頭孢米諾鈉的含量測(cè)定及配伍穩(wěn)定性觀察[J].中國(guó)藥物與臨床，2007，7(7):545－546.

[2]封家福，張錦，代廣會(huì)，等.反相高效液相色譜法測(cè)定注射用頭孢米諾鈉含量及其有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)藥業(yè)，2006，15(10):14－15.

[3]張濤.高效液相色譜法測(cè)定注射用頭孢米諾鈉的含量[J].天津藥學(xué)，2006，18(5):14－16.

[4]段威，夏東亞，郭濤.HPLC法測(cè)定人血漿中頭孢吡肟的濃度[J].中國(guó)藥房，2008，19(29):2262－2264.