Dex/PVA復(fù)合凝膠的制備及其對輔酶A的控制釋放

尹雙青 吉 民 姚日生

(1東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 211189)

(2馬鞍山豐原制藥有限公司，馬鞍山 243011)

(3合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，合肥 230009)

微凝膠是由交聯(lián)的聚合物粒子溶脹在適宜的溶劑中形成的，粒子直徑一般為1～1 000 nm，國內(nèi)外已有許多關(guān)于高分子微凝膠的報道［1-3］;葡聚糖是由葡萄糖糖苷鍵連接而成，分子內(nèi)含大量具有反應(yīng)活性的羥基，溶于水中能形成一定的膠體溶液，具有生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點［4］.以往關(guān)于葡聚糖微凝膠的研究報道，大多采用反相微乳(W/O)法合成，通常所制備的粒子中殘留的有機溶劑難以完全去除，限制了其在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用.現(xiàn)已有采用不含有機溶劑的全水相合成葡聚糖微凝膠的報道，形成的葡聚糖微凝膠溶脹性能好，具有溫度和pH敏感性等優(yōu)點［5］，但仍存在工藝條件難控制、粒度分布不均等問題，且因微凝膠分散在溶劑中，如要用作藥物載體材料，需要有與之配套的支撐材料.

聚乙烯醇(PVA)是一種水溶性高分子聚合物，具有無毒、生物相容性好、可生物降解等特點［6-9］，經(jīng)過冷凍處理的PVA水溶液可以形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的宏觀凝膠，強度高、穩(wěn)定性好［10-13］，但PVA宏觀凝膠用作藥物控釋載體時存在環(huán)境(如溫度)敏感性差［14］等問題.

本文運用真空冷凍干燥法，以葡聚糖-20(Dex)為原料，在水相體系中制得粒徑分布均勻的Dex微凝膠.在此基礎(chǔ)上，采用微波-凍融、真空冷凍干燥等技術(shù)在PVA宏觀凝膠的網(wǎng)絡(luò)中嵌入Dex微凝膠，生成含有Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠(Dex/PVA復(fù)合凝膠).將Dex微凝膠的溶脹性能及環(huán)境響應(yīng)性和PVA宏觀凝膠的力學(xué)性能有效結(jié)合起來，形成一種新型結(jié)構(gòu)的復(fù)合凝膠，并以輔酶A為模型分子，在不同溫度、不同pH值條件下，對復(fù)合凝膠的藥物控制釋放進行了研究.

1 實驗

1.1 材料與儀器

實驗材料有:葡聚糖-20(河南臨穎楓穎藥業(yè)有限公司)、聚乙烯醇(上海晶純試劑有限公司)、輔酶A(美國Sigma公司)、溴化鉀(色譜純，上海醫(yī)藥公司)和環(huán)氧氯丙烷(分析純，南臺中原化工廠);高碘酸鈉、氫氧化鈉、乙醇和吐溫-80均為市購分析純.

實驗儀器有:冷凍干燥機(FCM50D，美國STERIS公司)、高效液相色譜儀(2487，美國Waters公司)、水分測定儀(ZDJ，北京先驅(qū)公司)、X-射線衍射儀(D/Max-rB型，日本Rigaku公司)、磁力攪拌器(79HW21，江蘇金城國勝實驗儀器廠)和傅里葉紅外光譜(Nicolet5700，美國熱電公司);透射電子顯微鏡(TEM)(H-800，日本HITACHI公司)、激光粒度分析儀(DLS)(Nano-ZS90，英國Malvern公司);掃描電鏡(SEM)(JSM-6700F，日本JEOL公司)、拉伸試驗機(Intronol-1121，英國Intronol公司)和紫外可見分光光度計(WFZ8002D3B，上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.2 Dex/PVA復(fù)合凝膠的制備

取3 g Dex溶于200 mL注射用水中，加入1.5 mL NaOH標(biāo)液(0.5 mol/L)、2 mL環(huán)氧氯丙烷，在(48±2)℃溫度下磁力攪拌反應(yīng)20 h，反應(yīng)過程中滴加1～2滴穩(wěn)定劑，反應(yīng)液在凍干機中采用18 h真空冷凍干燥，制得Dex微凝膠，留樣進行表征.

取適量Dex微凝膠溶解于注射用水，再取適量PVA溶于注射用水中，微波(65±2)℃持續(xù)3～5 min配置成水溶液，二者混合后置于培養(yǎng)皿中，超聲排氣20～30 min，－18℃以下冷凍1.5 h，微波分別融化60 s，循環(huán)4次.常溫下用注射用水洗凈單體，18 h真空冷凍干燥，制得含Dex微結(jié)構(gòu)PVA凝膠.留樣進行溶脹率、TEM分析測試.

1.3 分析測試

Dex及其微凝膠的紅外光譜在Vector-22FT-IR傅里葉紅外光譜儀上測定，樣品采用KBr壓片法，掃描范圍4 000～400 cm－1;Dex及其微凝膠的X衍射圖用D/Max-rB型X-射線衍射儀進行連續(xù)掃描記譜測定，掃描范圍為0°～60°;Dex微凝膠溶液用超聲儀超聲處理后，滴于噴有碳膜的銅網(wǎng)上，在H-800型透射電鏡下觀測粒子大小及形狀，得到微凝膠TEM圖;Dex微凝膠制成溶液后，用Nano-ZS90型激光粒度分析儀(DLS)測試微凝膠水合粒徑，測試溫度25℃;含有不同量Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠的溶脹性能通過測定溶脹率來表示;復(fù)合凝膠的力學(xué)性能在微機控制電子萬能實驗機上測定其拉伸強度，樣品在注射用水中溶脹至恒重，拉伸速率100 mm/min;含有Dex微結(jié)構(gòu)PVA復(fù)合凝膠的SEM圖，用JSM-6700F型掃描電子顯微鏡掃描測定，事先在樣品表面鍍銀.

1.4 復(fù)合凝膠對輔酶A控制釋放

在一定溫度下，將復(fù)合凝膠浸泡在一定濃度的輔酶A水溶液中.間隔一定時間，用高效液相色譜法檢測水溶液中輔酶A的含量［15］，直至含量達到平衡時，復(fù)合凝膠對輔酶A吸附達到飽和，吸附量為

式中，X0，X1分別為輔酶A溶液在復(fù)合凝膠吸附前后的質(zhì)量分?jǐn)?shù);V為輔酶A溶液體積;M為水凝膠質(zhì)量.取出已經(jīng)達到吸附平衡的復(fù)合凝膠，用濾紙拭干其表面的水分，放置到磷酸緩沖溶液中，每隔一定的時間用移液管移取5 mL緩沖液，用高效液相色譜法檢測輔酶A的含量.每次測量后將樣品倒回，計算輔酶A的釋放量，測定結(jié)果以釋放率(釋藥量/載藥量)來表示.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同時間的藥物釋放量，再計算累積釋放量并繪制體外釋放曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 Dex及其微凝膠的紅外光譜

如圖1所示，Dex交聯(lián)后，在3 402 cm－1處的羥基(—OH)吸收峰減弱，表明Dex的部分羥基發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)生成了微凝膠，致使羥基數(shù)目減少.Dex微凝膠在1 007 cm－1處峰形變得尖銳，這是環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后，醚鍵增加所致.由此證明，Dex微凝膠的交聯(lián)反應(yīng)是成功的，Dex與環(huán)氧氯丙烷發(fā)生反應(yīng)生成了由醚氧鍵交聯(lián)的凝膠結(jié)構(gòu).

圖1 葡聚糖及其微凝膠的紅外圖譜

2.2 Dex及其微凝膠的X衍射分析

取樣品適量，研成粉末，采用X射線衍射儀對樣品連續(xù)掃描記譜，管壓40.0 kV，管流100.0 mA，CuKα輻射，波長為0.154 06 nm，石墨單色器濾波，掃描速度為6°/min，掃描范圍為0°～60°.狹縫尺寸:發(fā)散狹縫為1°，接收狹縫為0.3 mm，防發(fā)散狹縫為1°(見圖2).

圖2 右旋糖酐及其微凝膠的XRD圖

從圖2中可看出，Dex在2θ為15.3°，17.4°，18.7°，20.1°，28.9°附近存在明顯銳衍射峰，而Dex微凝膠在2θ為34.3°，46.4°附近存在銳衍射峰，21.5°附近存在寬大的漫射峰，表明交聯(lián)改性后的Dex微凝膠具有非晶性質(zhì)，屬于無定形狀態(tài).說明Dex改性后，原有的聚集狀態(tài)發(fā)生了改變，由結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形狀態(tài).由于Dex的結(jié)晶態(tài)分子排列規(guī)整，分子間的作用力強，外界溶劑及小分子難于滲入其中，而改性后的Dex微凝膠的無定形狀態(tài)相對分子排列雜亂，分子間的作用力弱，外界溶劑及小分子藥物易于滲入其中，故與小分子藥物的結(jié)合能力也有所提高.

2.3 Dex微凝膠形態(tài)、粒徑測試分析

圖3為用透射電鏡在加速電壓200 kV下觀測到的Dex微凝膠TEM圖.圖中顯示冷凍干燥法所得的Dex微凝膠(見圖3(a))呈球形，外形規(guī)整、分散良好，且微凝膠大小均勻，粒徑分布在100～200 nm之間，較普通干燥法得到的Dex微凝膠(見圖3(b)，粒徑100～300 nm)粒徑分布均勻.

圖3 Dex微凝膠的TEM圖

圖4為激光粒度分析儀(DLS)測量Dex微凝膠制成溶液后的水合粒徑分布圖.圖中顯示，凍干法制得微凝膠的水合粒徑較普通干燥法得到的微凝膠水合粒徑平均粒徑小，且分布相對集中.凍干法所得微凝膠的水合粒徑主要分布在0.4～1.0 μm，占82.56%，而普通干燥法得到的微凝膠水合粒徑分布主要在0.6～1.4μm，占81.84%.

圖4 Dex微凝膠水合粒徑的DLS檢測圖

另在模擬人體環(huán)境的條件下，將凍干法所制備的空白微凝膠放置在溫度37℃，pH 7.4的磷酸緩沖溶液中，1周后再測其粒徑，發(fā)現(xiàn)粒徑變化不大，說明微凝膠的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定.

2.4 Dex/PVA復(fù)合凝膠溶脹和力學(xué)性能測試

1)溶脹性能測試 將冷凍干燥法制備的含有不同量Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠烘至恒重.已知質(zhì)量的干凝膠浸泡在25℃的注射用水中，每隔一定時間，取出凝膠并用濾紙吸去表面水分，稱重，至凝膠溶脹平衡，凝膠的平衡溶脹率按下式計算:

式中，We為溶脹平衡時的復(fù)合凝膠質(zhì)量;Wd為干凝膠的質(zhì)量.實驗測得結(jié)果如圖5所示.圖中，WDex=mDex/(mDex+mPVA)×100%，mDex為Dex微凝膠量，mPVA為PVA凝膠質(zhì)量.

圖5 Dex/PVA復(fù)合凝膠溶脹率

2)力學(xué)性能測試 將復(fù)合凝膠樣品在注射用水中溶脹至恒重，裁成5 mm×10 mm的啞鈴形，置于拉伸試驗機上做拉伸，拉伸速率100 mm/min，測定其拉伸強度，結(jié)果如圖6所示.

圖6 Dex/PVA復(fù)合凝膠的拉伸強度

由圖6可以看出，隨著Dex微凝膠含量的增加，PVA復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu)疏松化會導(dǎo)致拉伸強度逐漸減小，當(dāng)Dex微凝膠加入量超過30%時，復(fù)合凝膠的拉伸強度會出現(xiàn)一個拐點，會明顯降低很多.

綜合復(fù)合凝膠的溶脹性能和力學(xué)性能測試，在PVA宏觀凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中嵌入30%Dex微凝膠的復(fù)合凝膠，能把Dex微凝膠良好的溶脹性能與PVA宏觀凝膠的力學(xué)性能有機結(jié)合起來.

2.5 Dex/PVA復(fù)合凝膠SEM表征

取網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中嵌入30%Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠表面鍍銀后，采用JSM-6700F型掃描電子顯微鏡掃描其形貌得SEM圖，用同樣的方法掃描PVA宏觀凝膠作對比(見圖7).

圖7 30%Dex/PVA復(fù)合凝膠和PVA宏觀凝膠的SEM圖

由圖7可以看出，PVA宏觀凝膠(見圖7(a))的結(jié)構(gòu)中存在大量空隙，具有吸水溶脹的結(jié)構(gòu)條件，同時由于凝膠的空隙分布致密，孔徑較小，溶脹性能欠佳;當(dāng)PVA凝膠中嵌入Dex微凝膠后(見圖7(b))，使得宏觀凝膠空隙變大，結(jié)構(gòu)分布變得松散，復(fù)合凝膠整體的致密度下降.相比于純PVA宏觀凝膠，30%Dex/PVA復(fù)合凝膠具有良好的溶脹性能，力學(xué)強度雖略有降低，但不影響其整體性能，可以作為藥物控制釋放的載體進行試驗.

2.6 不同載藥量復(fù)合凝膠對輔酶A的控制釋放

在常溫下，將30%Dex/PVA復(fù)合凝膠樣品分別浸泡在輔酶A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.20%，0.80%，0.50%，pH=7.4的緩沖溶液中，分別記作樣品A、樣品B和樣品C.間隔6 h用高效液相色譜法測定溶液中輔酶A的含量［15］，直到輔酶A的含量不變?yōu)橹?通過計算得到樣品A、樣品B和樣品C載藥量分別為6.9，4.8和2.6 mg/g.

將樣品A、樣品B和樣品C分別浸泡在溫度(37±0.5)℃，pH=7.4的磷酸緩沖溶液中，間隔6，12，…，72 h測定溶液中輔酶A的含量，其累積釋放率和時間的關(guān)系如圖8所示.由圖8可見，樣品A、樣品B和樣品C變化趨勢基本相同，都在6 h以內(nèi)出現(xiàn)突釋現(xiàn)象;在24 h時，累積釋放率分別為83%，78%和65%，之后釋放速率減緩;至48 h時，釋放基本達到平衡，累積釋放率分別為88%，84%和70%.由圖8中可以看出，復(fù)合凝膠在輔酶A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80%的緩沖溶液中制得的樣品B(輔酶A載藥量為4.8 mg/g)累積釋放率、釋放速度比較適中，可以作為復(fù)合凝膠對輔酶A控制釋放的研究模型.

該模塊可實現(xiàn)供應(yīng)商分類管理，實現(xiàn)合格供方的審核與積極評價功能、自定義審核流程；支持管理供應(yīng)商資質(zhì)檔案管理（文檔或圖片形式），支持提取合格供方目錄；實現(xiàn)供應(yīng)商有效管控，物資采購采用合格供方提供供貨范圍內(nèi)的物料。

圖8 不同載藥量凝膠對輔酶A的釋放曲線

2.7 復(fù)合凝膠對輔酶A控制釋放的溫度敏感性

制備9份載藥量為4.8 mg/g的樣品B，分別在溫度1，5，…，40℃條件下浸泡在pH=7.4的磷酸緩沖溶液中，間隔6，12，24，48 h測量緩沖溶液中輔酶A的含量，其中開始6 h內(nèi)每隔1 h測一次輔酶A的含量，不同時間對應(yīng)累積釋放率變化曲線如圖9所示.

由圖9可知，在開始6 h內(nèi)輔酶A出現(xiàn)不同程度的突釋現(xiàn)象，整體規(guī)律是:復(fù)合凝膠對輔酶A的控制釋放具有溫度敏感性，溫度越高釋放越快，達到釋放平衡的時間越短，累積釋放率也越高.在溫度1～10℃時，開始6 h內(nèi)突釋及至釋放平衡，釋放過程相似，釋放速度較慢，如10℃時，復(fù)合凝膠樣品中的輔酶A 6 h內(nèi)釋放32%，24 h釋放57%，至48 h累積釋放率僅69%.在溫度15℃以上時，開始6 h內(nèi)突釋及至釋放平衡，釋放過程明顯加快.如溫度在35℃時，復(fù)合凝膠樣品中的輔酶A 6 h內(nèi)就釋放58%，24 h釋放78%，至48 h基本達到釋放平衡，累積釋放率達到84%.由于PVA宏觀凝膠溫度敏感性差［14］，復(fù)合凝膠溫度敏感性主要是由其中Dex微結(jié)構(gòu)的性能所決定，Dex微凝膠具有良好的溫度敏感性，且粒徑越小溫度敏感性越強［5］.綜合分析，選擇釋放速度慢、控釋效果好，且條件易于控制的10℃作為下一步研究的溫度條件.

圖9 輔酶A隨時間變化的累積釋放率曲線

2.8 復(fù)合凝膠對輔酶A控制釋放的pH敏感性

制備3份載藥量為4.8 mg/g的樣品B，在(10±0.5)℃下，分別浸泡在pH=4.5，7.4，9.1的磷酸緩沖溶液中，間隔6，12，…，72 h，用高效液相色譜法測定體系中的輔酶A含量［15］，不同pH值對應(yīng)輔酶A累積釋放率變化曲線如圖10所示.

圖10 不同pH值輔酶A隨時間變化的累積釋放率曲線

由圖10可以看出，在開始6 h都發(fā)生突釋現(xiàn)象，隨后釋放速率變緩，直至釋放平衡.3種pH值條件下的輔酶A累積釋放率均是非線性增長的，且復(fù)合凝膠都具有一定的緩控釋效果，對載有輔酶A的復(fù)合凝膠在不同時間累積釋放率的數(shù)據(jù)點進行擬合，其釋放過程可用y=Axn1/(B+Cxn2)函數(shù)描述，所得方程如下:

1)pH=4.5

2)pH=7.4

3)pH=9.1

當(dāng)pH=4.5時，n1=0.27表明藥物釋放主要受擴散控制，這是因為在酸性緩沖溶液中，H+容易與凝膠網(wǎng)絡(luò)中Dex微結(jié)構(gòu)表面的羥基以及醚氧鍵中氧原子上的孤對電子結(jié)合形成烊鹽離子，從而增加了凝膠的親水性，使復(fù)合凝膠處于溶脹狀態(tài)，對輔酶A的容納量也較大.同時酸性條件下輔酶A以磷酸基的形式存在，可以與凝膠網(wǎng)絡(luò)之間形成氫鍵等分子間作用力，從而在一定程度上減緩了輔酶A分子的釋放，但由于輔酶A的釋放以擴散為主，當(dāng)復(fù)合凝膠處于溶脹狀態(tài)時，環(huán)境中酸性的水分子易進入凝膠內(nèi)部，逐漸與凝膠內(nèi)原有的結(jié)合水發(fā)生交換.隨著時間的延長，凝膠中吸附的輔酶A和緩沖溶液之間存在的濃度差驅(qū)使輔酶A被緩慢釋放出來，結(jié)果6 h內(nèi)輔酶A累積釋放率26%，48 h累積釋放率69%，至72 h累積釋放率達到81%.

當(dāng)pH=9.1時，n1=0.60表明藥物釋放仍主要受擴散影響，但在堿性環(huán)境中，凝膠快速收縮，其中的內(nèi)部自由水被迫迅速失去，輔酶A隨著自由水一起被快速擠了出來.又因輔酶A為有機弱酸，在堿性溶液中，以離子的形式存在，與凝膠網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用降低，促進了輔酶A分子的釋放.且當(dāng)凝膠收縮完全后，堿性的水分子不易進入凝膠內(nèi)部，凝膠內(nèi)結(jié)合水中溶有的輔酶A分子留存在了凝膠內(nèi)，結(jié)果在開始6 h內(nèi)輔酶A就累積釋放率48%，至36 h達到釋放平衡時累積釋放率僅為62%.

當(dāng)pH=7.4時，n1=0.82表明藥物釋放受擴散和其他多種因素的影響.在中性環(huán)境中，一方面凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中羥基以無電荷狀態(tài)存在而相互間形成氫鍵，使凝膠趨于收縮狀態(tài)，使輔酶A隨著水分子一起被釋放出來;另一方面凝膠中嵌入的Dex微結(jié)構(gòu)分子中的亞甲基由于疏水作用而使凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的收縮受到影響.綜合作用使得開始6 h輔酶A累積釋放率32%，48 h累積釋放率69%，至72 h累積釋放率為73%.

綜上所述，復(fù)合凝膠中的輔酶A在酸性緩沖溶液中釋放速度最慢，但平衡時累積釋放率最高，復(fù)合凝膠對輔酶A控制釋放能力最強;在堿性緩沖溶液中釋放速度最快，但累積釋放率最低;在中性緩沖溶液中的釋放速度和累積釋放率介于酸性和堿性之間.

3 結(jié)論

1)真空冷凍干燥法較普通干燥法制得的Dex微凝膠粒徑小、分布均勻、大小在100～200 nm之間，結(jié)合微波融化和真空冷凍干燥法制得的含有Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠，能把Dex微凝膠良好的溶脹性能與PVA宏觀凝膠的力學(xué)性能有效結(jié)合起來，形成了一種新型結(jié)構(gòu)的復(fù)合凝膠.

2)復(fù)合凝膠在輔酶A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80%的磷酸緩沖溶液中制得的樣品，載藥量為4.8 mg/g，累積釋放率、釋放速度較為適中，可以作為凝膠對輔酶A控制釋放的研究模型.

3)在pH=7.4的磷酸緩沖溶液中，通過比較在不同溫度復(fù)合凝膠對輔酶A的控制釋放的影響.研究發(fā)現(xiàn)，溫度越高釋藥速度越快，達到釋放平衡的時間越短，累積釋放率越高.

4)在溫度為(10±0.5)℃時，通過對pH=4.5，7.4，9.1的緩沖溶液中復(fù)合凝膠對輔酶A的控制釋放試驗，研究發(fā)現(xiàn)，pH=9.1時，輔酶A釋放速率最快，但累積釋放率最低;pH=4.5時，輔酶A釋放速率最慢，但累積釋放率最高，復(fù)合凝膠對輔酶A的控制釋放能力最強.

5)含有30%Dex微結(jié)構(gòu)的PVA復(fù)合凝膠，對輔酶A的控制釋放具有溫度和pH值雙重敏感性，在藥物制劑的緩控釋載體材料方面具有較好的應(yīng)用前景.

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