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    吉林省延邊地區(qū)豬附紅細(xì)胞體病分子流行病學(xué)調(diào)查

    2011-08-16 07:44:28劉明明賈立軍薛書江梁晚?xiàng)?/span>張守發(fā)
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2011年11期
    關(guān)鍵詞:膜蛋白體病延邊

    劉明明,賈立軍,薛書江,梁晚?xiàng)?,張守發(fā)

    (延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,吉林延吉 133002)

    附紅細(xì)胞體?。‥perythrozoonsis)是由附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓中引起的一種以高熱、貧血、黃膽等為主要臨床特征的人畜共患病[1-3]。豬、牛、羊、馬、犬、貓、雞和鼠等多種動(dòng)物及人均可感染發(fā)病,其中以豬附紅細(xì)胞體病最為嚴(yán)重[4]。不同品系、性別和年齡的豬均可感染附紅細(xì)胞體病,四季均有發(fā)生,以夏秋兩季更易發(fā)病。該病多以隱性感染為主,在從未感染過的地區(qū)則常出現(xiàn)嚴(yán)重的地方性流行和暴發(fā),不僅給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重影響人類的身心健康[5]。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR方法對(duì)2009—2011年間采自吉林省延邊地區(qū)的237頭份豬血液樣本進(jìn)行了豬附紅細(xì)胞體病流行病學(xué)調(diào)查,旨在為延邊地區(qū)豬附紅細(xì)胞體病提供科學(xué)的流行病學(xué)資料,以便有效控制該病的流行與發(fā)展。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣本來源

    237份豬血液樣本采自吉林省延邊地區(qū)延吉、和龍、圖們、琿春及龍井等5個(gè)縣市,頸靜脈無菌采集抗凝血,-20℃保存,備用。

    1.1.2 主要試劑

    rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker、DNA 提取試劑盒等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

    1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細(xì)胞體膜蛋白OxaA 序列(CBZ40902.1),應(yīng)用 Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,上游引物 P1:5'-TCTTATGTCTTTGTTGTAAATCTG-3';下游引物 P2:5'-TTTTCAATCTATGTTCACCTCA-3'。擴(kuò)增片段大小386 bp;對(duì)照用引物的靶基因?yàn)?6 S rRNA,上游引物 P1:5'-CGAAAGTCTGATGGAGCAATAC-3';下游引物 P2:5'-AACCAAACATCTCAAGACACGA-3',擴(kuò)增片段大小703 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR檢測(cè)

    將采集的237份豬血液樣本,應(yīng)用DNA提取試劑盒提取基因組DNA,以基因組DNA為模板,以膜蛋白OxaA為靶基因的PCR擴(kuò)增體系為25μL:10×Bufer 2.5 μL,dNTP 2 μL,rTaq DNA Polymerase 0.3μL,引物(10 pmol/L)各 1.5μL,DNA 模板 2 μL。優(yōu)化后的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;94℃變性45s,57℃退火 45s,72℃延伸 45s,共 30 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min,4℃結(jié)束反應(yīng)。同時(shí)進(jìn)行16 S rRNA靶基因的PCR擴(kuò)增[6]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

    1.2.2 檢測(cè)結(jié)果的比較

    應(yīng)用敏感性最好的靶基因PCR方法對(duì)吉林省延邊地區(qū)5個(gè)縣市采集的237份豬血液樣本,進(jìn)行不同地區(qū)、不同年齡段、不同季節(jié)及不同飼養(yǎng)方式的豬附紅細(xì)胞體感染情況的比較。

    2 結(jié)果

    2.1 兩種不同靶基因引物的PCR檢測(cè)結(jié)果

    以豬附紅細(xì)胞體膜蛋白OxaA序列(CBZ40902.1)設(shè)計(jì)引物建立的PCR方法對(duì)采集的237份豬血液樣本進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)與16 S rRNA設(shè)計(jì)引物的PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明,以膜蛋白OxaA為靶基因的PCR方法較16 S rRNA為靶基因的PCR方法陽性檢出率高,結(jié)果見表1。故選擇膜蛋白OxaA為靶基因的PCR方法作為此次流行病學(xué)調(diào)查的最佳方法(見表1)。

    表1 兩種不同靶基因引物的PCR檢測(cè)結(jié)果比較

    2.2 不同地區(qū)豬附紅細(xì)胞體感染情況PCR檢測(cè)結(jié)果

    以靶基因膜蛋白OxaA為引物的PCR為準(zhǔn),對(duì)237份采自延吉、和龍、圖們、琿春和龍井5個(gè)縣市的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果見表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各縣市豬附紅細(xì)胞體感染率差異不顯著(P>0.05)(見表 2)。

    表2 不同地區(qū)豬附紅細(xì)胞體感染情況比較

    2.3 不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

    以靶基因膜蛋白OxaA為引物的PCR為準(zhǔn),對(duì)237份不同年齡的種母豬、育肥豬、斷奶仔豬和哺乳仔豬的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),感染情況見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體陽性率差異不顯著(P>0.05)(見表 3)。

    表3 不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

    2.4 不同季節(jié)豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

    以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn),對(duì)237份采自不同季節(jié)的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,夏秋兩季豬附紅細(xì)胞體陽性率顯著高于冬春兩季(P<0.05)(見表 4)。

    表4 不同季節(jié)豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

    2.5 不同飼養(yǎng)方式豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

    以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn),對(duì)237份采自不同飼養(yǎng)方式的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,農(nóng)戶飼養(yǎng)方式豬附紅細(xì)胞體陽性率顯著高于規(guī)模化養(yǎng)殖方式(P<0.01)(見表5)。

    表5 不同飼養(yǎng)方式豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

    2.6 部分臨床樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果

    以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn),對(duì)237份血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),部分臨床樣本PCR檢測(cè)結(jié)果見圖1。

    3 討論

    附紅細(xì)胞體為條件性致病微生物,當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降或感染其它病原時(shí),附紅細(xì)胞體在血液中就會(huì)大量增殖,繼發(fā)引起各種疾病的交叉感染,導(dǎo)致動(dòng)物死亡,極大影響了畜牧業(yè)健康發(fā)展[7-8]。本次調(diào)查采用了PCR方法對(duì)吉林省延邊地區(qū)237頭份豬血液樣本進(jìn)行檢測(cè),并事先對(duì)兩種不同靶基因的引物進(jìn)行比較,排除假陰性樣本的干擾,以便更為準(zhǔn)確的檢測(cè)出豬附紅細(xì)胞體病。

    本次調(diào)查對(duì)檢測(cè)的237頭份豬血液樣本按不同地區(qū)、年齡、季節(jié)及飼養(yǎng)方式的感染情況分別進(jìn)行了比較,結(jié)果表明豬附紅細(xì)胞體的感染與季節(jié)和飼養(yǎng)方式的關(guān)系較密切,受地區(qū)和年齡影響較小。

    調(diào)查結(jié)果顯示,吉林省延邊地區(qū)在2009—2011年間豬附紅細(xì)胞體的平均感染率為23.6%,這與2008年李月梅等對(duì)吉林省豬附紅細(xì)胞體感染率的調(diào)查相比有明顯的下降[9],但與國(guó)外研究結(jié)果顯示的附紅細(xì)胞體在豬群中的患病率約為10%~15%相比還是偏高[10]。因此,附紅細(xì)胞體病作為養(yǎng)豬業(yè)的潛在威脅,其危害不容忽視。鑒于目前附紅細(xì)胞體病的研究現(xiàn)狀,對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的防治研究仍是一項(xiàng)艱巨任務(wù)。

    [1]Messick JB,Smith G,Berent L,et al.Genome size of Epery throzoon suis and hybridization with 16S rRNA gene[J].Can J Microbiol,2000,46(11):1082-1086.

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    [5]呂舟,鄭秀紅,張守發(fā),等.不同佐劑對(duì)豬附紅細(xì)胞體亞單位疫苗免疫效果的影響[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2009,26(3):42-43.

    [6]陳啟軍,尹繼剛,劉明遠(yuǎn).附紅細(xì)胞體及附紅細(xì)胞體病[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,26(4):460-464.

    [7]鄭秀紅,賈立軍,邢瑩,等.豬附紅細(xì)胞體單管巢式PCR診斷方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(2):205-208.

    [8]羅峰,韋進(jìn)鐘,盧慶.附紅細(xì)胞體病的病原生物學(xué)與診斷研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2009,26(1):65-68.

    [9]劉聚祥,李輝,姜富成,等.豬附紅細(xì)胞體病最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2010,27(5):66-68.

    [10]李月梅,薛書江,其木格,等.應(yīng)用PCR方法調(diào)查東北三省部分地區(qū)豬附紅細(xì)胞體病流行情況 [J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(11):36-37.

    [11]Hoelzle K,Doser S,Ritzmann M,et al.Vaccination with the Mycoplasma suis recombinant adhesion protein MSG1 elicits a strong immune response but fails to induce protection in pigs[J].Vaccine,2009,27(39):5376-5382.

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