豬繁殖與呼吸綜合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因變異分析

韋正吉，陳 強，嚴斯剛

（廣西柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州 545005）

高致病性豬藍耳?。℉P-PRRS）經(jīng)過2006—2007年的全國大流行后[1-5]，在2008—2009年較為平穩(wěn)，僅出現(xiàn)零星散發(fā)。2009年年底在河南、湖北和山東等省出現(xiàn)了較大范圍的高致病性豬藍耳病流行。2010年4月份開始在福建、廣東和廣西等南方省份部分養(yǎng)豬密集的區(qū)域出現(xiàn)了高致病性豬藍耳病的疫情，其中有些豬場發(fā)病非常嚴重，造成了較大的損失。主要表現(xiàn)為母豬發(fā)燒、停食、懷孕母豬大范圍流產(chǎn)、母豬或生長肥育豬有較高的死亡率，產(chǎn)房小豬和保育豬死亡率較高，可達到80%甚至100%。

藍耳病病毒經(jīng)過幾年的演化變異后，在臨床上出現(xiàn)了新毒株的流行趨勢，病毒基因是否又出現(xiàn)了新的特點。為弄清這次流行病的病原特點，我們從本地檢測的PRRSV陽性病料進行了NSP2和ORF5基因的序列測定及分析，以為柳州本地預防和控制豬繁殖與呼吸綜合癥提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

對2010年6—9月臨床送檢的疑似豬藍耳病病料經(jīng)RT-PCR方法檢測[6]，選擇2份陽性病料作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒測序的模板，病料編號為LZ5和LZ6；PRRSV疫苗毒株（CH-1R株）購自上海海利生物藥品有限公司。

1.2 主要試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）有限公司；rTaq DNA聚合酶、反轉錄酶（AMV）、RNA 酶抑制劑、dNTP（10 mmol/μL）、隨機引物（9mer）和 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自東盛生物公司；限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（E.coli）DH5α為廣西大學動物科學技術學院惠贈。

1.3 引物的選擇與合成

根據(jù)GenBank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的基因序列及有關文獻[1，7]設計針對NSP2和ORF5基因的引物。引物序列如下：NSP2-F1：5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3'；NSP2-R1：5'-CCA AGT CAG CAT GTC AAC CCT ATC-3'，所擴增的片段理論大小約為796bp。ORF5-F1：5'-CTG AGA CCA TGA GGT GGG CAA CT-3'；ORF5-R1：5'-CAT CACTGGCGT GTA GGT AAT AGA AAA C-3'，所擴增的片段理論大小約為748 bp。引物委托寶生物工程（大連）有限公司合成。引物合成后，稀釋至25 pmol/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒核酸抽提

PRRSV的總RNA根據(jù)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明方法進行提取，抽提所得的總RNA立即進行反轉錄合成cDNA或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 cDNA第一鏈的合成

將抽提所得的總RNA進行cDNA的合成，RT反應條件：采用25μL的cDNA合成體系，即于0.2 mL反應管中，PRRSV的RNA樣品各15.5μL，分別加入5×RT Buffer 5μL，Random 9mers（50pmol/μL）1μL，dNTP Mixture（10mmol/μL each）2 μL，Rnase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase XL（5U/μL）1μL，置于PCR儀中進行cDNA合成，以25 ℃10 min，42℃ 60 min，96℃ 2 min的程序進行一個循環(huán)，結束cDNA合成后，進行PCR擴增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 NSP2和ORF5基因的PCR擴增

PCR反應均采用25.0μL的反應體系，即10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶 0.3μL、引物各 1.0μL、模板 2.0μL，最后用滅菌雙蒸水補至25.0μL。經(jīng)反復篩選，NSP2基因擴增的PCR反應最優(yōu)條件為：95℃預變性5 min；然后 94 ℃ 1 min、59 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。ORF5基因擴增的PCR反應最優(yōu)條件為：95℃預變性5 min；然后94℃1 min、56℃ 50 s、72℃ 1 min，進行 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.7 DNA回收與純化

PCR產(chǎn)物的純化，采用凝膠電泳切膠回收。用DNA凝膠回收試劑盒（東盛生物）回收電泳PCR產(chǎn)物50μL，經(jīng)回收后溶解于30μL無菌雙蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 連接、轉化、克隆及基因測序

將RT-PCR擴增片段純化回收后，按pMD18-T載體說明書，分別將目的基因連接入pMD18-T載體中，按常規(guī)方法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選白斑，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。每個毒株挑選五個克隆搖菌，用堿裂解法提取質粒，以PCR法及酶切法鑒定篩選陽性重組子，并由寶生物工程（大連）有限公司測序。應用DNA Star軟件對測序結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因的RT-PCR

用所設計的引物分別進行RT-PCR擴增NSP2和ORF5基因，分別獲得與預期片段大小相符的特異性片段。所選的陽性樣品LZ5、LZ6能擴出NSP2基因大小約為796 bp的片段，擴出ORF5基因大小約為748 bp的片段，均與預期相吻合（圖1、2）。

2.2 NSP2和ORF5基因cDNA的克隆及鑒定

NSP2和ORF5基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別插入pMD18-T載體的外源基因插入位點。挑取轉化DH5α后的單菌落（白斑）進行培養(yǎng)，直接以培養(yǎng)的菌液為模板進行PCR鑒定，分別擴增出NSP2基因（約796 bp）和ORF5基因（約748 bp）目的片段。所選的PCR陽性質粒經(jīng)酶切鑒定，都出現(xiàn)預期的目的片段。

2.3 NSP2和ORF5基因序列的測定

選2個鑒定為陽性的重組質粒進行測序，獲得LZ5、LZ6株目的基因片段核苷酸序列，部分NSP2基因序列長均為796bp，含ORF5基因序列長均為749 bp。通過Blast分析表明兩者均為PRRSV基因序列。

表1 LZ5、LZ6與其它毒株之間的NSP2、ORF5核苷酸序列及氨基酸序列同源性

2.4 序列分析

運用DNAStar分析軟件將所測得的柳州流行毒株LZ5、LZ6的部分NSP2基因、ORF5基因與已發(fā)表的VR2332株、LV株、CH-1a株、MLV株和國內(nèi)高致病性藍耳病代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1及近年廣西分離的部分代表性毒株進行核苷酸及其推導的氨基酸序列同源性比較，結果見表1。LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7%，其推導的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5% ；LZ5、LZ6的NSP2基因與近年國內(nèi)分離的高致病性藍耳病代表性毒株基因序列高度同源，具有完全一致的缺失特征，在NSP2基因的第483位和535~563位氨基酸發(fā)生缺失（圖3）。

2.5 系統(tǒng)進化分析

應用DNAstar軟件中的MegAlign功能，分別繪制柳州PRRSV流行株 LZ5、LZ6與國內(nèi)外標準參考毒株及部分廣西代表性毒株NSP2和ORF5基因推導的氨基酸序列遺傳進化樹。根據(jù)ORF5基因氨基酸序列繪制的遺傳進化樹，所比較的14個PRRSV毒株明顯分為兩個基因群（圖4）。歐洲型代表毒株LV與其它毒株距離都很遠，為單獨一群。LZ5、LZ6和國內(nèi)分離株與國際美洲型代表株VR2332關系較近，共同構成另一群，屬美洲型，該群分為兩個亞群：LZ5、LZ6 與 2006 年夏高熱病PRRSV的代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1 及 近 年 廣西分離的高致病性藍耳病毒株構成第一亞群；弱毒疫苗株MLV （RespPRRS/Repro）和 國內(nèi)第一分離株CH-1a與VR2332株構成另一亞群。根據(jù)NSP2基因氨基酸序列繪制的遺傳進化樹與ORF5的結果大體一致（圖 5），所變化的是 LZ5、LZ6和國內(nèi)近年分離的高致病性PRRSV與CH-1a株遺傳距離相對較近，共同構成美洲型（群） 的第一亞群，MLV和VR2332株則構成另一亞群。遺傳進化樹結合核苷酸及氨基酸序列同源性可以看出：LZ5、LZ6與近幾年分離流行的高致病性藍耳病毒株基因序列高度同源，與2006年夏高熱病引起的PRRSV相比基因序列并未顯示出新的特性，很有可能均是由國內(nèi)第一分離株CH-1a變異進化而來。

3 討論

3.1 根據(jù)DNAStar軟件分析，本試驗研究擴增的LZ5、LZ6株NSP2基因發(fā)生30個氨基酸的不連續(xù)缺失，具有與近幾年國內(nèi)分離的高致病性藍耳病代表性毒株（HEB1、HUB2和JXA1）完全一致的基因序列缺失特征。結合臨床病理特征表明，LZ5、LZ6株為流行于我市的高致病性PRRSV。

3.2 本研究柳州分離株LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7% ，其推導的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5%；LZ5、LZ6與近年廣西分離的高致病性PRRSV的NSP2和ORF5基因核苷酸序列同源性分別為94.7%~95.7%和97.2%~98.0%，其推導的氨基酸序列同源性分別為92.0%~94.7%和94.5%~97.0%；與2006年夏高熱病PRRSV的代表性毒株（HEB1、HUB2和JXA1）基因核苷酸序列同源性分別為95.4%~96.2%和97.7%~98.0%，其推導的氨基酸序列同源性分別為94.3%~95.5%和96.0%~97.0%?；蛐蛄蟹治霰砻鳎琇Z5、LZ6與2006年夏高熱病引起的PRRSV基因序列高度同源，在基因序列上并未顯示出新的特性，也未出現(xiàn)明顯的地域差異性。

3.3 LZ5、LZ6株與歐洲型代表 LV株 NSP2和ORF5等位基因的氨基酸同源性分別為18.9%和59.7%，與美洲型代表VR2332株等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.5%（或 86.0%），故 LZ5、LZ6屬美洲型毒株，這與氨基酸序列遺傳進化樹劃分的基因歸屬結果一致。

3.4 遺傳進化樹分析結果，LZ5、LZ6和近年分離的高致病性PRRSV與疫苗株MLV（RespPRRS/Repro）雖然同歸屬于美洲型（群），但確歸屬于不同的亞型。LZ5、LZ6與MLV的NSP2和ORF5等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.0%（或85.5%），基因變異較大。結果表明柳州本地PRRSV野毒正向遠離疫苗毒MLV的方向變異，提示在實際防疫中應該選擇與當?shù)亓餍卸局暝诳乖陨舷嚓P的種毒制備疫苗免疫是有效防控該病的關鍵。

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