• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬繁殖與呼吸綜合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因變異分析

    2011-08-16 07:44:32韋正吉嚴斯剛
    中國動物檢疫 2011年11期
    關鍵詞:進化樹耳病核苷酸

    韋正吉,陳 強,嚴斯剛

    (廣西柳州市動物疫病預防控制中心,廣西柳州 545005)

    高致病性豬藍耳?。℉P-PRRS)經(jīng)過2006—2007年的全國大流行后[1-5],在2008—2009年較為平穩(wěn),僅出現(xiàn)零星散發(fā)。2009年年底在河南、湖北和山東等省出現(xiàn)了較大范圍的高致病性豬藍耳病流行。2010年4月份開始在福建、廣東和廣西等南方省份部分養(yǎng)豬密集的區(qū)域出現(xiàn)了高致病性豬藍耳病的疫情,其中有些豬場發(fā)病非常嚴重,造成了較大的損失。主要表現(xiàn)為母豬發(fā)燒、停食、懷孕母豬大范圍流產(chǎn)、母豬或生長肥育豬有較高的死亡率,產(chǎn)房小豬和保育豬死亡率較高,可達到80%甚至100%。

    藍耳病病毒經(jīng)過幾年的演化變異后,在臨床上出現(xiàn)了新毒株的流行趨勢,病毒基因是否又出現(xiàn)了新的特點。為弄清這次流行病的病原特點,我們從本地檢測的PRRSV陽性病料進行了NSP2和ORF5基因的序列測定及分析,以為柳州本地預防和控制豬繁殖與呼吸綜合癥提供理論數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 毒株

    對2010年6—9月臨床送檢的疑似豬藍耳病病料經(jīng)RT-PCR方法檢測[6],選擇2份陽性病料作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒測序的模板,病料編號為LZ5和LZ6;PRRSV疫苗毒株(CH-1R株)購自上海海利生物藥品有限公司。

    1.2 主要試劑

    UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒,購自生工生物工程(上海)有限公司;rTaq DNA聚合酶、反轉錄酶(AMV)、RNA 酶抑制劑、dNTP(10 mmol/μL)、隨機引物(9mer)和 DNA Marker,購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自東盛生物公司;限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;大腸桿菌(E.coli)DH5α為廣西大學動物科學技術學院惠贈。

    1.3 引物的選擇與合成

    根據(jù)GenBank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的基因序列及有關文獻[1,7]設計針對NSP2和ORF5基因的引物。引物序列如下:NSP2-F1:5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3';NSP2-R1:5'-CCA AGT CAG CAT GTC AAC CCT ATC-3',所擴增的片段理論大小約為796bp。ORF5-F1:5'-CTG AGA CCA TGA GGT GGG CAA CT-3';ORF5-R1:5'-CAT CACTGGCGT GTA GGT AAT AGA AAA C-3',所擴增的片段理論大小約為748 bp。引物委托寶生物工程(大連)有限公司合成。引物合成后,稀釋至25 pmol/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 病毒核酸抽提

    PRRSV的總RNA根據(jù)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明方法進行提取,抽提所得的總RNA立即進行反轉錄合成cDNA或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 cDNA第一鏈的合成

    將抽提所得的總RNA進行cDNA的合成,RT反應條件:采用25μL的cDNA合成體系,即于0.2 mL反應管中,PRRSV的RNA樣品各15.5μL,分別加入5×RT Buffer 5μL,Random 9mers(50pmol/μL)1μL,dNTP Mixture(10mmol/μL each)2 μL,Rnase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL,AMV Reverse Transcriptase XL(5U/μL)1μL,置于PCR儀中進行cDNA合成,以25 ℃10 min,42℃ 60 min,96℃ 2 min的程序進行一個循環(huán),結束cDNA合成后,進行PCR擴增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 NSP2和ORF5基因的PCR擴增

    PCR反應均采用25.0μL的反應體系,即10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶 0.3μL、引物各 1.0μL、模板 2.0μL,最后用滅菌雙蒸水補至25.0μL。經(jīng)反復篩選,NSP2基因擴增的PCR反應最優(yōu)條件為:95℃預變性5 min;然后 94 ℃ 1 min、59 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s,進行35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。ORF5基因擴增的PCR反應最優(yōu)條件為:95℃預變性5 min;然后94℃1 min、56℃ 50 s、72℃ 1 min,進行 35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

    1.7 DNA回收與純化

    PCR產(chǎn)物的純化,采用凝膠電泳切膠回收。用DNA凝膠回收試劑盒(東盛生物)回收電泳PCR產(chǎn)物50μL,經(jīng)回收后溶解于30μL無菌雙蒸水中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.8 連接、轉化、克隆及基因測序

    將RT-PCR擴增片段純化回收后,按pMD18-T載體說明書,分別將目的基因連接入pMD18-T載體中,按常規(guī)方法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑選白斑,接種于含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。每個毒株挑選五個克隆搖菌,用堿裂解法提取質粒,以PCR法及酶切法鑒定篩選陽性重組子,并由寶生物工程(大連)有限公司測序。應用DNA Star軟件對測序結果進行分析。

    2 結果與分析

    2.1 目的基因的RT-PCR

    用所設計的引物分別進行RT-PCR擴增NSP2和ORF5基因,分別獲得與預期片段大小相符的特異性片段。所選的陽性樣品LZ5、LZ6能擴出NSP2基因大小約為796 bp的片段,擴出ORF5基因大小約為748 bp的片段,均與預期相吻合(圖1、2)。

    2.2 NSP2和ORF5基因cDNA的克隆及鑒定

    NSP2和ORF5基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別插入pMD18-T載體的外源基因插入位點。挑取轉化DH5α后的單菌落(白斑)進行培養(yǎng),直接以培養(yǎng)的菌液為模板進行PCR鑒定,分別擴增出NSP2基因(約796 bp)和ORF5基因(約748 bp)目的片段。所選的PCR陽性質粒經(jīng)酶切鑒定,都出現(xiàn)預期的目的片段。

    2.3 NSP2和ORF5基因序列的測定

    選2個鑒定為陽性的重組質粒進行測序,獲得LZ5、LZ6株目的基因片段核苷酸序列,部分NSP2基因序列長均為796bp,含ORF5基因序列長均為749 bp。通過Blast分析表明兩者均為PRRSV基因序列。

    表1 LZ5、LZ6與其它毒株之間的NSP2、ORF5核苷酸序列及氨基酸序列同源性

    2.4 序列分析

    運用DNAStar分析軟件將所測得的柳州流行毒株LZ5、LZ6的部分NSP2基因、ORF5基因與已發(fā)表的VR2332株、LV株、CH-1a株、MLV株和國內(nèi)高致病性藍耳病代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1及近年廣西分離的部分代表性毒株進行核苷酸及其推導的氨基酸序列同源性比較,結果見表1。LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7%,其推導的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5% ;LZ5、LZ6的NSP2基因與近年國內(nèi)分離的高致病性藍耳病代表性毒株基因序列高度同源,具有完全一致的缺失特征,在NSP2基因的第483位和535~563位氨基酸發(fā)生缺失(圖3)。

    2.5 系統(tǒng)進化分析

    應用DNAstar軟件中的MegAlign功能,分別繪制柳州PRRSV流行株 LZ5、LZ6與國內(nèi)外標準參考毒株及部分廣西代表性毒株NSP2和ORF5基因推導的氨基酸序列遺傳進化樹。根據(jù)ORF5基因氨基酸序列繪制的遺傳進化樹,所比較的14個PRRSV毒株明顯分為兩個基因群(圖4)。歐洲型代表毒株LV與其它毒株距離都很遠,為單獨一群。LZ5、LZ6和國內(nèi)分離株與國際美洲型代表株VR2332關系較近,共同構成另一群,屬美洲型,該群分為兩個亞群:LZ5、LZ6 與 2006 年夏高熱病PRRSV的代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1 及 近 年 廣西分離的高致病性藍耳病毒株構成第一亞群;弱毒疫苗株MLV (RespPRRS/Repro)和 國內(nèi)第一分離株CH-1a與VR2332株構成另一亞群。根據(jù)NSP2基因氨基酸序列繪制的遺傳進化樹與ORF5的結果大體一致(圖 5),所變化的是 LZ5、LZ6和國內(nèi)近年分離的高致病性PRRSV與CH-1a株遺傳距離相對較近,共同構成美洲型(群) 的第一亞群,MLV和VR2332株則構成另一亞群。遺傳進化樹結合核苷酸及氨基酸序列同源性可以看出:LZ5、LZ6與近幾年分離流行的高致病性藍耳病毒株基因序列高度同源,與2006年夏高熱病引起的PRRSV相比基因序列并未顯示出新的特性,很有可能均是由國內(nèi)第一分離株CH-1a變異進化而來。

    3 討論

    3.1 根據(jù)DNAStar軟件分析,本試驗研究擴增的LZ5、LZ6株NSP2基因發(fā)生30個氨基酸的不連續(xù)缺失,具有與近幾年國內(nèi)分離的高致病性藍耳病代表性毒株(HEB1、HUB2和JXA1)完全一致的基因序列缺失特征。結合臨床病理特征表明,LZ5、LZ6株為流行于我市的高致病性PRRSV。

    3.2 本研究柳州分離株LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7% ,其推導的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5%;LZ5、LZ6與近年廣西分離的高致病性PRRSV的NSP2和ORF5基因核苷酸序列同源性分別為94.7%~95.7%和97.2%~98.0%,其推導的氨基酸序列同源性分別為92.0%~94.7%和94.5%~97.0%;與2006年夏高熱病PRRSV的代表性毒株(HEB1、HUB2和JXA1)基因核苷酸序列同源性分別為95.4%~96.2%和97.7%~98.0%,其推導的氨基酸序列同源性分別為94.3%~95.5%和96.0%~97.0%?;蛐蛄蟹治霰砻鳎琇Z5、LZ6與2006年夏高熱病引起的PRRSV基因序列高度同源,在基因序列上并未顯示出新的特性,也未出現(xiàn)明顯的地域差異性。

    3.3 LZ5、LZ6株與歐洲型代表 LV株 NSP2和ORF5等位基因的氨基酸同源性分別為18.9%和59.7%,與美洲型代表VR2332株等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.5%(或 86.0%),故 LZ5、LZ6屬美洲型毒株,這與氨基酸序列遺傳進化樹劃分的基因歸屬結果一致。

    3.4 遺傳進化樹分析結果,LZ5、LZ6和近年分離的高致病性PRRSV與疫苗株MLV(RespPRRS/Repro)雖然同歸屬于美洲型(群),但確歸屬于不同的亞型。LZ5、LZ6與MLV的NSP2和ORF5等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.0%(或85.5%),基因變異較大。結果表明柳州本地PRRSV野毒正向遠離疫苗毒MLV的方向變異,提示在實際防疫中應該選擇與當?shù)亓餍卸局暝诳乖陨舷嚓P的種毒制備疫苗免疫是有效防控該病的關鍵。

    [1]童光志,周艷君,郝曉芳,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析 [J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(9):323-327.

    [2]郝曉芳,周艷君,田志軍,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立 [J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(9):704-709.

    [3]Tian K G,Yu X L,Zhao T Z,et al.Emergence of Fatal PRRSV Variants:Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark[J/OL].PLoS ONE,2007,2(6):e526.http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000526.

    [4]謝麗基,謝芝勛,劉加波,等.廣西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位預測 [J].動物醫(yī)學進展,2008,29(1):1-4.

    [5]劉濤,陳賽娟,孫繼國,等.河北豬繁殖與呼吸綜合征病毒地方株HB-4(hs)株ORF5-7基因變異分析 [J].華北農(nóng)學報,2008,23(4):32-36.

    [6]韋正吉,嚴斯剛,黃小武,等.多重RT-PCR同時檢測CSFV、PRRSV、HP-PRRSV方法的建立及其臨床應用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2009,40(11):1476-1480.

    [7]李和平,吳發(fā)興,鄭忠屹,等.我國部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株ORF5基因的遺傳變異分析 [J].中國動物檢疫,2005,22(10):23-26.

    猜你喜歡
    進化樹耳病核苷酸
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關性研究進展
    徐長風:核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    基于心理旋轉的小學生物進化樹教學實驗報告
    耳病治鼻,事出有因
    中老年保健(2021年4期)2021-08-22 07:07:22
    常見的進化樹錯誤概念及其辨析*
    生物學通報(2021年9期)2021-07-01 03:24:44
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    豬藍耳病的防控
    廣東飼料(2016年2期)2016-12-01 03:43:08
    一例高致病性豬藍耳病的診治
    高致病性藍耳病的診斷和治療
    女性生殖器流出的白浆| 免费观看性生交大片5| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产爽快片一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产av码专区亚洲av| 国产精品偷伦视频观看了| 中国三级夫妇交换| 青青草视频在线视频观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品久久精品一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲av福利一区| 一边亲一边摸免费视频| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久久久久久大av| 日日撸夜夜添| 亚洲av成人精品一二三区| 国产成人91sexporn| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩大片免费观看网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产综合精华液| 免费黄色在线免费观看| 精品久久久噜噜| 人体艺术视频欧美日本| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产成人av激情在线播放 | 午夜视频国产福利| 欧美xxⅹ黑人| 桃花免费在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 99热这里只有精品一区| 日韩欧美一区视频在线观看| 五月开心婷婷网| 九九在线视频观看精品| 男女边摸边吃奶| 精品久久久久久电影网| 免费大片18禁| 熟女人妻精品中文字幕| 精品亚洲成国产av| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本午夜av视频| 国产精品三级大全| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品久久久久久精品古装| 免费少妇av软件| 免费高清在线观看日韩| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产色片| 99久久人妻综合| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲综合色网址| 男男h啪啪无遮挡| 99热这里只有是精品在线观看| 精品久久久噜噜| 久久女婷五月综合色啪小说| 在线观看免费日韩欧美大片 | 久久久国产欧美日韩av| 少妇高潮的动态图| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av福利一区| 久久午夜福利片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 老女人水多毛片| 国产在线视频一区二区| 精品熟女少妇av免费看| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美另类一区| 男人爽女人下面视频在线观看| av在线app专区| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品视频女| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 午夜免费鲁丝| 免费观看的影片在线观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品美女久久av网站| 只有这里有精品99| 高清av免费在线| 精品国产国语对白av| 久久精品久久久久久久性| 精品视频人人做人人爽| 全区人妻精品视频| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 美女大奶头黄色视频| freevideosex欧美| 一区二区三区精品91| 91国产中文字幕| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 一个人免费看片子| 丝袜脚勾引网站| 综合色丁香网| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久精品区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品日本国产第一区| 人妻少妇偷人精品九色| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 女性被躁到高潮视频| 午夜激情av网站| 超碰97精品在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| videos熟女内射| 精品人妻一区二区三区麻豆| 99热这里只有精品一区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 久久久久久久久久久丰满| 久热久热在线精品观看| 亚洲精品456在线播放app| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩一区二区三区影片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产 精品1| tube8黄色片| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品久久午夜乱码| 超碰97精品在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| av在线观看视频网站免费| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品久久久久久久性| a级片在线免费高清观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一边摸一边做爽爽视频免费| 人妻 亚洲 视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 伦理电影免费视频| 午夜激情福利司机影院| 在线播放无遮挡| 交换朋友夫妻互换小说| 少妇人妻 视频| 久久久久视频综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久久久久精品精品| av电影中文网址| av电影中文网址| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚州av有码| 久久人妻熟女aⅴ| 精品久久久久久久久av| av在线观看视频网站免费| 亚洲av二区三区四区| 美女中出高潮动态图| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜91福利影院| av天堂久久9| 日韩大片免费观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 日本-黄色视频高清免费观看| 蜜桃在线观看..| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品一区二区三区视频在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产探花极品一区二区| 日韩中字成人| 亚洲av福利一区| 亚洲精品久久午夜乱码| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产乱人偷精品视频| 日本欧美视频一区| 伦精品一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 天天操日日干夜夜撸| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 婷婷色综合www| 久久久久久久国产电影| 亚洲图色成人| 国产淫语在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 成人无遮挡网站| 99热6这里只有精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 男人操女人黄网站| 亚洲国产av影院在线观看| 在线观看国产h片| 女性被躁到高潮视频| av在线老鸭窝| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲情色 制服丝袜| 高清毛片免费看| 久久人妻熟女aⅴ| 男女边吃奶边做爰视频| 热99国产精品久久久久久7| 欧美成人午夜免费资源| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 18禁在线播放成人免费| 99热这里只有精品一区| 亚洲无线观看免费| 女人精品久久久久毛片| 曰老女人黄片| 97精品久久久久久久久久精品| 赤兔流量卡办理| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲四区av| 免费看不卡的av| 国产一区二区三区av在线| 久久 成人 亚洲| 久久这里有精品视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 777米奇影视久久| 亚洲精品色激情综合| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费高清在线观看视频在线观看| 七月丁香在线播放| 在线观看国产h片| 我要看黄色一级片免费的| 国产亚洲一区二区精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 美女中出高潮动态图| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品自拍成人| av免费在线看不卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品,欧美精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产av国产精品国产| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 夫妻午夜视频| 欧美精品亚洲一区二区| 91成人精品电影| 久久鲁丝午夜福利片| 久久免费观看电影| 亚州av有码| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 少妇被粗大猛烈的视频| 在线观看国产h片| 丝袜在线中文字幕| 熟女电影av网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一个人免费看片子| 国产精品成人在线| 最近手机中文字幕大全| 国产在线免费精品| 高清av免费在线| 伊人久久国产一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区二区三区av在线| 国产精品一国产av| 免费看不卡的av| 亚洲经典国产精华液单| 一区二区三区精品91| 多毛熟女@视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产视频内射| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 高清视频免费观看一区二区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 精品久久久精品久久久| 99热这里只有精品一区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99热网站在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 99热全是精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 有码 亚洲区| 国产精品久久久久久久久免| 国产男女超爽视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 黄色欧美视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线看a的网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 一区二区av电影网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产有黄有色有爽视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av.av天堂| 日本黄色片子视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 丝袜美足系列| 不卡视频在线观看欧美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 51国产日韩欧美| 亚洲经典国产精华液单| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 极品少妇高潮喷水抽搐| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美+日韩+精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 最近2019中文字幕mv第一页| 国产成人精品福利久久| 成人影院久久| 午夜精品国产一区二区电影| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 视频在线观看一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 一区二区三区精品91| 在线观看国产h片| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 在线看a的网站| 久久影院123| 成年av动漫网址| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av福利一区| 下体分泌物呈黄色| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品不卡视频一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av一本久久久久| 日本欧美国产在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 一级,二级,三级黄色视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99视频精品全部免费 在线| xxx大片免费视频| 99热全是精品| 亚洲中文av在线| 国产精品人妻久久久影院| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 男女免费视频国产| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 五月开心婷婷网| 国产男女内射视频| 婷婷色综合www| 少妇的逼水好多| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色吧在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| videos熟女内射| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线观看人妻少妇| 中文天堂在线官网| 久久午夜综合久久蜜桃| 高清毛片免费看| 91精品三级在线观看| 久久久久久久久大av| 午夜激情福利司机影院| av有码第一页| 99久久中文字幕三级久久日本| 下体分泌物呈黄色| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 韩国av在线不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品一区在线观看国产| 自线自在国产av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看免费高清a一片| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲经典国产精华液单| www.色视频.com| 下体分泌物呈黄色| 午夜视频国产福利| av免费观看日本| 在线观看免费高清a一片| 九九爱精品视频在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 色5月婷婷丁香| 3wmmmm亚洲av在线观看| 插阴视频在线观看视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲成人av在线免费| 99热国产这里只有精品6| 伊人亚洲综合成人网| √禁漫天堂资源中文www| 日本黄色片子视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 最后的刺客免费高清国语| 国产色婷婷99| 天天操日日干夜夜撸| 中国国产av一级| 亚洲美女搞黄在线观看| 18在线观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 一本久久精品| 国产av码专区亚洲av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久久久久久久大奶| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费黄色在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕制服av| 国产免费一级a男人的天堂| 久久影院123| 国产成人精品一,二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲国产精品国产精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 少妇的逼水好多| 色吧在线观看| 中文字幕制服av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 大片免费播放器 马上看| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩制服骚丝袜av| 日本黄色片子视频| 我的老师免费观看完整版| 制服人妻中文乱码| 精品久久久噜噜| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 男女无遮挡免费网站观看| 制服诱惑二区| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美人与善性xxx| 亚洲综合色网址| 999精品在线视频| 大陆偷拍与自拍| 国产视频首页在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 国产av精品麻豆| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 免费av中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av天美| 美女大奶头黄色视频| 久久久久久久精品精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲无线观看免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 飞空精品影院首页| 日本黄色日本黄色录像| 综合色丁香网| www.av在线官网国产| 高清不卡的av网站| 岛国毛片在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美最新免费一区二区三区| 性色avwww在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 久久人人爽人人片av| 街头女战士在线观看网站| 99热这里只有精品一区| 欧美bdsm另类| 日本欧美视频一区| 夫妻午夜视频| 免费大片黄手机在线观看| 91精品国产国语对白视频| 色94色欧美一区二区| 欧美日韩av久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 五月伊人婷婷丁香| 日日啪夜夜爽| 一级片'在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产精品一区三区| 大香蕉久久网| 能在线免费看毛片的网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美精品亚洲一区二区| 精品熟女少妇av免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级a做视频免费观看| 在线观看人妻少妇| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品国产自在天天线| 老司机影院成人| 最近中文字幕2019免费版| 久久午夜福利片| 黑丝袜美女国产一区| 婷婷色综合www| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 午夜视频国产福利| 18禁在线播放成人免费| 一个人免费看片子| 国产一区二区三区av在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 人妻系列 视频| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲成人一二三区av| 日本午夜av视频| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av成人精品一二三区| 国产一级毛片在线| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品嫩草影院av在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄片播放在线免费| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲综合色网址| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 777米奇影视久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 少妇人妻 视频| 晚上一个人看的免费电影| 色94色欧美一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲在久久综合| 久久影院123| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久ye,这里只有精品| 精品一区二区三卡| 一级毛片 在线播放| 日日啪夜夜爽| 制服诱惑二区| 韩国av在线不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 性色avwww在线观看| 成人免费观看视频高清| 午夜免费鲁丝| 高清视频免费观看一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 少妇人妻 视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 色吧在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩精品有码人妻一区| 18禁观看日本| 男人操女人黄网站| 九九爱精品视频在线观看| 777米奇影视久久| 黄色欧美视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产av码专区亚洲av| 一级黄片播放器| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩成人伦理影院| 一本久久精品| 国产熟女午夜一区二区三区 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久久精品久久久| a级毛片在线看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 一级毛片电影观看| 久久久国产精品麻豆| 2021少妇久久久久久久久久久| 五月伊人婷婷丁香| 国产免费又黄又爽又色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人妻夜夜爽99麻豆av| 91精品国产九色| 99热网站在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 大片电影免费在线观看免费| 精品视频人人做人人爽| 色哟哟·www| av视频免费观看在线观看| 一级a做视频免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一级毛片 在线播放| videos熟女内射| 97超视频在线观看视频| 一个人免费看片子| 国产一区亚洲一区在线观看| 日本91视频免费播放| 日韩中文字幕视频在线看片| 丝袜喷水一区| 亚洲av福利一区| av在线老鸭窝| 午夜激情久久久久久久| 久久久精品免费免费高清|