神經(jīng)再生與缺血性腦卒中的研究*

蔡世昌 白 波 張秋玲

(1．泰山醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，山東泰安 271000; 2．濟寧醫(yī)學院，山東 濟寧 272000)

腦卒中是臨床常見病和多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率和高復發(fā)率的特點。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發(fā)病率占腦卒中的70% ～80%，猝死率更是高達80%以上，給人類帶來極大的危害。其預后差的主要原因是腦缺血再灌注后損傷的腦組織修復不佳，至今尚無有效的方法來完全修復受損組織。減少缺血造成的腦細胞死亡級聯(lián)反應和增加新的有功能的神經(jīng)細胞是兩個研究方向。神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSCs)是由胚胎早期室管膜上皮產(chǎn)生的一種具有多向分化潛能的前體細胞。干細胞研究的迅猛發(fā)展給臨床腦卒中治療帶來了巨大的機遇，一些神經(jīng)性病變和應激能促進干細胞的激活。新近的研究［1～3］證實，腦缺血可以刺激機體處于應激狀態(tài)，從而激活室管膜下層等部位的神經(jīng)干細胞增殖分化。本文從國內(nèi)外對缺血性腦卒中后神經(jīng)細胞的再生、遷移、分化的最新研究進展作一綜述。

1 神經(jīng)干細胞的特征及在成人腦內(nèi)的分布

神經(jīng)干細胞存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，其處于較原始的未分化狀態(tài)，具有自我復制產(chǎn)生與父代完全一致的子代細胞的能力，并且可以多向分化，演變成不同類型的神經(jīng)細胞。傳統(tǒng)觀念認為神經(jīng)元只在胚胎期增殖，成年個體的神經(jīng)元是終末細胞，不再具有分裂能力。20世紀末，有學者首次提出中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在神經(jīng)干細胞的概念，并證明它能分化成三種神經(jīng)細胞，從而為神經(jīng)系統(tǒng)的研究開辟了一個全新的領域。目前已證實成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)終身存在神經(jīng)干細胞，其不斷進行少量有絲分裂進行自我復制以補充丟失的神經(jīng)細胞。在成年哺乳動物腦內(nèi)的海馬、腦室下區(qū)、大腦皮質(zhì)、大腦脈絡叢、室管膜、紋狀體和嗅球等地方都有神經(jīng)干細胞;而以側腦室的室管膜下層(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(subgranular zone，SGZ)兩個區(qū)增殖能力最強。

2 NSCs再生規(guī)律及影響因素

正常生理情況下，哺乳動物體內(nèi)的神經(jīng)干細胞非常少，基本可以認為其處于靜息狀態(tài)。但神經(jīng)生發(fā)中心一直存在，在病理狀態(tài)下誘發(fā)其增殖。然后再沿著特定的通路向所需部位遷移，在其周圍微環(huán)境的影響下分化成特定神經(jīng)細胞。神經(jīng)干細胞的再生、增殖、分化和遷移在時間上和空間上是一個同步協(xié)調(diào)的過程，最終是否分化成為有功能的正常神經(jīng)細胞受很多因素的影響。哺乳動物的種屬、性別、年齡、遺傳和飲食都是影響因素之一，還有腦內(nèi)微環(huán)境中的神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、激素水平、神經(jīng)生長因子等也都參與了神經(jīng)元再生過程的調(diào)節(jié)。其中神經(jīng)因子和激素對再生神經(jīng)細胞的影響發(fā)展最為迅速。之前已經(jīng)確認表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)注入動物腦室內(nèi)能明顯增加室周區(qū)內(nèi)細胞的增殖和增加SGZ神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化成熟的比例，但不增加成熟神經(jīng)元的比例;堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)則可以使新生小鼠腦內(nèi)新生神經(jīng)細胞數(shù)增加;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)也可以使小鼠腦室內(nèi)和嗅球新生神經(jīng)元的數(shù)量增加，但高水平的BDNF表達抑制其向神經(jīng)元分化。國內(nèi)外有大量的研究證實激素對NSC分化的調(diào)控有顯著的影響。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，生長激素能夠促進神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖;雌激素通過其受體(ERs)影響神經(jīng)細胞的遷移和分化，一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的內(nèi)源性雌激素可以對NSC進行定向調(diào)控;甲狀腺激素能調(diào)控CNS的發(fā)育，決定NSC的分化過程，甚至還能影響成年動物NSC的增殖與成熟;外源性胰島素注射能增強視網(wǎng)膜NSC的可塑性;褪黑激素(melatonin，Mt)可以促使神經(jīng)干細胞明顯增殖，并且向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。視黃酸(retinoic acid，RA)也可以促使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，促進神經(jīng)細胞成熟，這需要神經(jīng)生長因子的參與。內(nèi)源性或外源性紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)都可以促進SVZ內(nèi)神經(jīng)干細胞的增殖和分化;糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)則對NSC的增殖和分化起到抑制作用，以維持神經(jīng)發(fā)生的平衡。

除常見的激素之外，新發(fā)現(xiàn)的一些激素和神經(jīng)肽類激素也參與神經(jīng)細胞再生的調(diào)節(jié)。Ghrelin是新發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽，其能夠促進神經(jīng)細胞分化。Chen 等［4］證實脂聯(lián)素(adiponectin，APN)能通過抑制NF-κB(p65)的轉運而起到抗炎作用，從而對腦缺血再灌注損傷起到有效的保護作用。Lauren A等［5］發(fā)現(xiàn)G蛋白耦聯(lián)受體血管緊張素受體AT1相關的受體蛋白(putative receptor protein related to the angiotensinreceptor AT1，APJ)的天然配體 Apelin能誘導Akt和Raf/ERK-1/2的磷酸化，保護海馬神經(jīng)元對抗 N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)興奮性毒性損傷，作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護因子保護大腦神經(jīng)細胞，Cook［6］進一步證實了這個觀點。Zhang等［7］認為瘦素(Leptin)增強降鈣素基因相關蛋白(calcitonin gene related protein，CGRP8-37)的表達，也可以上調(diào)bcl-2表達和抑制凋亡因子caspase-3。這些聯(lián)合作用能顯著的對抗腦缺血缺氧造成的損傷。盛寶英等［8］證明半乳凝素1可促進大鼠腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞原位增殖，并出現(xiàn)向外周腦實質(zhì)遷移的趨勢。激肽釋放-激肽系統(tǒng)可以通過誘導腦缺血區(qū)新生血管生成，改善腦缺血缺氧而起到腦保護作用。成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)作為一種絲裂原促進神經(jīng)干細胞的增殖分化，有效促使腦缺血后腦組織的修復［9］?？傊?，神經(jīng)元再生受到諸多因素的影響。

3 神經(jīng)干細胞治療缺血性腦卒中的兩種策略

目前，利用神經(jīng)干細胞來治療腦卒中有兩種策略，一種是外源性神經(jīng)干細胞移植，另一種為內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的活化。

3．1 外源性神經(jīng)干細胞移植治療缺血性腦卒中

3．1．1 NSCs移植治療研究現(xiàn)狀

神經(jīng)干細胞移植治療腦卒中是臨床研究的總領域之一，目前主要分兩類，一類是直接利用移植來的神經(jīng)干細胞替代損傷腦細胞。另一類是移植經(jīng)過基因修飾的細胞，這些細胞整合了基因編碼的細胞因子，這些因子能促進NSCs的增殖、分化和遷移。不同來源的神經(jīng)干細胞進行移植已經(jīng)有大量的報道。有學者把體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植到缺血后的大鼠側腦室內(nèi)，觀察到移植的神經(jīng)干細胞能遷徒到缺血區(qū)域分化為神經(jīng)元細胞，從而改善大鼠的運動功能，起到替代治療的作用。Parr等［10］采用體外培養(yǎng)強化綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，EGFP)標記的成年大鼠脊髓神經(jīng)干細胞，再把這種神經(jīng)干細胞移植到脊髓損傷部位及其頭側或尾側1 mm脊髓內(nèi)，實驗顯示，移植第7天病變部位以外的移植區(qū)存活細胞數(shù)量明顯比其他組增多。Dasari等［11］將人臍血干細胞直接注射到大鼠模型的脊髓損傷部位。結果發(fā)現(xiàn)，人臍血干細胞可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞并且損傷區(qū)軸索超微結構正常，新分化的少突膠質(zhì)細胞能夠分泌BDNF和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophic factor-3，NT-3)，移植的人臍血干細胞還能促進髓鞘再生，這些都有效改善大鼠脊髓損傷后的運動功能。Ao等［12］證明用嗅神經(jīng)鞘細胞和神經(jīng)干細胞聯(lián)合移植治療神經(jīng)損傷能起到良好效果，神經(jīng)干細胞增殖分化新生神經(jīng)細胞補充丟失的神經(jīng)細胞，嗅神經(jīng)鞘細胞促進髓鞘的形成并且引導軸索延長，從而能讓神經(jīng)細胞軸索順利穿過膠質(zhì)瘢痕盡快恢復功能。胡蘇華等［13］發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠腦內(nèi)移植神經(jīng)干細胞，在修復過程中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、層粘連蛋白(laminin，LN)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)有不同程度的表達增加。結果說明了神經(jīng)干細胞移植后在局部增殖、遷移并分化成為損傷修復所需神經(jīng)細胞，同時形成新生微血管，重建和改善微循環(huán)，共同構建新的神經(jīng)系統(tǒng)統(tǒng)一體，最終重建具有正常功能的神經(jīng)元網(wǎng)絡。

誘導神經(jīng)干細胞向具有合成某些特異性遞質(zhì)能力的神經(jīng)元分化，目前還沒有找到成熟的方法，利用基因工程修飾體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞是這一領域的重大進展;陳柏齡等［14］利用Ang-1基因修飾的兔自體骨髓基質(zhì)細胞(rabbit mesenchymal stem cells，rMSCs)作為移植源細胞，遷移至腦損傷區(qū)分化為神經(jīng)細胞并能較長期存活;說明MSCs移植與其分泌的Ang-1蛋白有協(xié)同作用，共同促進腦梗死后神經(jīng)功能的恢復。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs除了能分化為間充質(zhì)細胞譜系外，還能分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元。

3．1．2 NSCs移植暴露的問題

對移植治療神經(jīng)損傷來說，自體神經(jīng)干細胞的來源是一大難題。Medici［15］證明血管內(nèi)皮細胞轉變?yōu)槎嗄軜痈杉毎?，這就為干細胞移植來源提供了理論依據(jù)。也有學者嘗試利用攜帶外源性基因的神經(jīng)干細胞來建立永生化的中樞神經(jīng)干細胞系，從而解決干細胞來源難題，但外源基因的可控性、穩(wěn)定性、安全性、同源程度及與轉化相關的變化尚未很好的解決。雖然目前胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞在體外培養(yǎng)中都可以分化為神經(jīng)細胞，但是分化成人們所設計的特定神經(jīng)細胞的比例并不高，而且每次人工誘導分化都會存在一定程度的差異，無法做到產(chǎn)出的神經(jīng)細胞完全均一;并且移植的神經(jīng)干細胞在形態(tài)上的成活并不標志著一定就具有了功能，因此有作者擔心，將沒有統(tǒng)一標準的并不穩(wěn)定體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞直接移植給患者，可能會帶來災難性的后果。干細胞移植有可能導致腫瘤已經(jīng)為多數(shù)人認同，并成為干細胞研究關注的焦點之一。理論上認為只要具有分裂增生能力的細胞植入動物體，一旦無限制的生長，就具備形成腫瘤的可能。現(xiàn)有研究證實成熟度相對高的神經(jīng)干細胞移植后同樣具有較高的致瘤性。目前有人利用自體的成熟神經(jīng)細胞通過核酸重排使其具有分裂能力［16］，從而形成新的自體細胞移植源。而這種自體移植源細胞可以通過基因集成技術在神經(jīng)細胞分化過程中誘導其定向分化［17］，從理論上講有可能解決自體神經(jīng)干細胞移植的相關問題。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定免疫源性，它通過活化的具有抗原提呈特性的淋巴細胞和小膠質(zhì)細胞起作用，對外源性移植物具有排斥反應，這就使利用外源性神經(jīng)干細胞移植來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷受到了極大的挑戰(zhàn)。也有學者［18］發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)細胞功能恢復中免疫系統(tǒng)和神經(jīng)干細胞具有協(xié)同作用。

3．2 內(nèi)源性神經(jīng)細胞再生治療缺血性腦卒中研究現(xiàn)狀

目前已知在腦出血、腦缺血、腦外傷、癲癇和神經(jīng)變性疾病等一些病理條件下會激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分裂增殖。Liu等［19］首次證實短暫性全腦缺血可激發(fā)大腦內(nèi)源性的神經(jīng)細胞再生，從此掀起研究腦缺血后神經(jīng)細胞再生現(xiàn)象的熱潮。這種神經(jīng)發(fā)生不是一個短暫現(xiàn)象，其至少可以持續(xù)4個月之久。動物實驗證實一側局灶性腦缺血后雙側SGZ和SVZ均有神經(jīng)細胞再生現(xiàn)象，缺血側比非缺血側神經(jīng)細胞再生明顯增多，并隨時間而增多，到缺血后第4周可高達93%，說明了腦缺血損傷程度直接影響神經(jīng)干細胞的增殖。夾閉大腦中動脈30 min就能引起齒狀回區(qū)(dentate gyrus，DG)輕度、可變的神經(jīng)干細胞增殖，而夾閉2 h后則發(fā)現(xiàn)DG區(qū)新生細胞數(shù)明顯增多，且其不依賴于海馬神經(jīng)元的凋亡。Zepeda等［20］研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷導致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過度，打破了神經(jīng)細胞信號系統(tǒng)平衡，伴隨細胞骨架蛋白、NMDA受體和GABA受體表達出現(xiàn)改變，從而改變了神經(jīng)細胞生存的微環(huán)境，導致神經(jīng)元細胞凋亡。但這種變化也是大腦生發(fā)中心神經(jīng)干細胞增殖和分化的重要誘因。腦缺血不但可以刺激半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞的再生，還可以影響再生神經(jīng)細胞的遷移。腦缺血可以促使新生的神經(jīng)細胞從同側的SVZ區(qū)向對側受損的紋狀體區(qū)遷移。這是因為巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞分泌的骨橋蛋白導致遷移線路的改變［21］。再生神經(jīng)細胞遷移后的進一步分化也取得了成功。Hou等［22］在栓塞前1天的大鼠大腦中用含EGFP的逆轉錄病毒標記分裂細胞，觀察到大鼠腦缺血28 d后，遷移至受損紋狀體區(qū)段的神經(jīng)干細胞分化為GABA能神經(jīng)元和類膽堿能神經(jīng)元。這兩種神經(jīng)元可逐漸形成樹突，產(chǎn)生動作電位，并能夠與損傷紋狀體內(nèi)原有的神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系。這就證明了腦缺血后SVZ區(qū)再生的神經(jīng)元具備功能且能整合到原有神經(jīng)回路中，與正常SVZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生過程類似。

在神經(jīng)細胞信號系統(tǒng)方面也有重大突破。Notch1信號通路被認為是胚胎神經(jīng)干細胞發(fā)育調(diào)節(jié)的主要因素，Wang等［23］觀察到成年大鼠Notch1基因主要表達在新生神經(jīng)元，而Notch1的配體Jagged 1主要表達在SVZ的星形膠質(zhì)細胞。腦缺血4～24 h可激活Notch1信號通路NICD(notch intracellular domain)和下游轉錄基因Hes1、Shh，相應的SVZ區(qū)的細胞增殖，阻斷Notch1信號通路也就抑制了腦缺血誘導的神經(jīng)再生。說明Notch1信號通路在正常的和腦缺血誘導的神經(jīng)再生中起著關鍵作用。Wnt家族是神經(jīng)干細胞調(diào)節(jié)的另一關鍵信號通路。刑雪松等［24］研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注7 d wnt-1基因表達最強，與Brdu免疫組化結果一致。結果說明wnt-1基因在成人機體處于靜止狀態(tài)，腦缺血后表達，在神經(jīng)干細胞早期增殖、遷移、分化中起重要調(diào)控作用。Castillo［25］也證實wnt-1信號通路在神經(jīng)干細胞增殖分化中起重要作用。

4 總結與展望

綜上所述，腦缺血導致神經(jīng)細胞死亡成級聯(lián)反應，同時也激活了靜態(tài)的神經(jīng)干細胞分化以對抗神經(jīng)細胞的大量死亡。在腦缺血再灌注早期，新生神經(jīng)細胞的增殖主要集中在雙側側腦室的VZ/SVZ，其他腦區(qū)僅有零星的增殖細胞。局灶性腦缺血和全腦缺血都能激發(fā)神經(jīng)細胞的增殖，增殖的新生神經(jīng)細胞能主動向損傷區(qū)域遷移。在增殖和遷移的過程中都受很多因素的影響，目前在調(diào)控這些因素方面神經(jīng)科學家們做了大量工作，取得一定效果，但沒有一個統(tǒng)一的結論。利用外源性的神經(jīng)干細胞移植也取得了很大的突破，但如何克服技術和倫理的束縛，按照預期的設計穩(wěn)定的分化成所需細胞并且遷移到特定部位還沒有成熟技術。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的活化治療腦卒中較神經(jīng)干細胞移植有不受倫理約束，沒有排斥反應和細胞毒性，沒有誘發(fā)腫瘤的危險等優(yōu)勢，利用神經(jīng)干細胞的增殖能力在腦缺血再灌注早期就能大量的、穩(wěn)定的替代損失的神經(jīng)細胞，從而使臨床腦卒中的危害降到最低是神經(jīng)學科學家未來要做的工作。

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