水貂阿留申病研究進(jìn)展

張慶明，王玉平，雷連成

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春，130062)

水貂阿留申病(AD)是由細(xì)小病毒科阿留申水貂病毒屬水貂阿留申病毒(ADV)引起的，主要侵染水貂、病程緩慢的傳染性疾病。阿留申病毒對(duì)水貂的健康有嚴(yán)重的影響，能夠使水貂呈現(xiàn)多種不同的臨床癥狀。新生水貂表現(xiàn)為急性肺炎，成年水貂則表現(xiàn)為伴有高γ－球蛋白和腎小球腎炎等癥狀的慢性免疫系統(tǒng)失調(diào)。ADV主要侵染水貂，不僅感染阿留申基因型水貂，其他所有基因型的水貂都易感，只是非阿留申型水貂的癥狀較輕。

1 病原學(xué)

水貂阿留申病毒(ADV)屬于細(xì)小病毒科，阿留申水貂病毒屬，無囊膜，直徑22～25 nm，不含脂質(zhì)和糖類，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)，為單鏈線性DNA病毒。該病毒因其堅(jiān)實(shí)緊密的形態(tài)結(jié)構(gòu)而對(duì)外界物理化學(xué)因素的抵抗力非常強(qiáng)。能抵抗乙醚和氯仿，且耐熱，80℃時(shí)可存活1 h，90℃時(shí)可耐受10 min，100℃ 3 min仍能保持感染性。在5℃時(shí)，福爾馬林體積分?jǐn)?shù)為0．03的溶液約2周處理仍有活力，耐受4周才滅活。在pH 2．8～10．0的環(huán)境中均能保持活力，但蛋白酶處理時(shí)，病毒滴度明顯下降。可被紫外線、0．5 mol/L的鹽酸、5 g/L的碘溶液及20 g/L的氫氧化鈉溶液滅活［1～4］。

Porte等［5］證明，阿留申病病毒可以在他們所試驗(yàn)的39種細(xì)胞中的5種水貂細(xì)胞株、一種非洲綠猴腎細(xì)胞和人的細(xì)胞株WI－38中有限地產(chǎn)生阿留申病毒抗原。在感染后2 d，抗原發(fā)現(xiàn)于核內(nèi)，在感染后3～4 d，小量的抗原有時(shí)也見于胞漿內(nèi)，通常僅1%的細(xì)胞含有抗原，感染4 d以后，則難以檢測(cè)到抗原。1977年，Hahn等［6］在貓腎細(xì)胞系CRFK內(nèi)，通過免疫熒光方法確定核內(nèi)存在病毒抗原。1980年，Bloom等［7］報(bào)道阿留申病病毒(ADV－G)在31．8℃的條件下可于CRFK細(xì)胞內(nèi)增殖。

2 分子生物學(xué)

1988年，Bloom等［8］完成了ADV－G亞型的基因序列測(cè)定，其基因共包含4 801個(gè)核苷酸?；蚪M的兩端均存在回文序列，并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，共有4個(gè)編碼蛋白的開放閱讀框架(OFR)，分別為:左開放閱讀框架(L－ORF)、右開放閱讀框架(R－ORF)和2個(gè)短的可編碼小于10 ku多肽的中間開放閱讀框架(MORF1 和 MORF2)。L－ORF 對(duì)應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)，R－ORF 對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白1，2(VP1，VP2)，M－ORF對(duì)應(yīng)其他非結(jié)構(gòu)蛋白。

ADV的復(fù)制位點(diǎn)位于細(xì)胞核中，發(fā)生于宿主細(xì)胞的復(fù)制間期(S期)［9］。ADV－G在CRFK細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，由位于3MU的啟動(dòng)子(P3啟動(dòng)子)啟動(dòng)合成Rl，R2，R2′，和RX等4種mRNA，而位于36MU的P36啟動(dòng)子負(fù)責(zé)啟動(dòng)R3mRNA的合成。

3 發(fā)病機(jī)理

從1940年發(fā)現(xiàn)AD以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)AD的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量的研究工作?；谀壳皣?guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)論，ADV感染所造成的宿主動(dòng)物的損傷主要可歸結(jié)為兩個(gè)方面:

阿留申病是典型的免疫復(fù)合物病。動(dòng)物體感染ADV后，體內(nèi)存在高滴度的抗病毒抗體，但病毒并不被IgG中和。在慢性感染水貂血清中的阿留申病病毒雖被抗體結(jié)合，但不能被中和，病毒也不從宿主體內(nèi)被清除出去。這些免疫復(fù)合物在血液中循環(huán)，沉積于腎小球及其它器官動(dòng)脈管壁的基底膜，引起腎小球及其它組織的損害，病理表現(xiàn)為腎小球腎炎及動(dòng)脈血管炎等。

巨噬細(xì)胞為ADV侵染的靶細(xì)胞。ADV對(duì)巨噬細(xì)胞的侵染，引發(fā)了宿主動(dòng)物免疫機(jī)能紊亂。巨噬細(xì)胞作為參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要免疫細(xì)胞之一，ADV在其體內(nèi)的復(fù)制，必將對(duì)其功能產(chǎn)生一定的影響。而巨噬細(xì)胞功能紊亂所引發(fā)的連鎖反應(yīng)，可能最終導(dǎo)致漿細(xì)胞增多和高水平γ－球蛋白的出現(xiàn)。

4 診 斷

阿留申病的實(shí)驗(yàn)室診斷包括以下幾個(gè)方面:

4．1 病原學(xué)檢查

1976年，Brummerstedr，E［10］在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有2種不同顆粒，典型的病毒顆粒約22～24 nm，而較小的顆粒為10～12 nm，這種較小顆?？赡転殍F蛋白。常國(guó)權(quán)等［11］采用直接電鏡和膠體金免疫電鏡技術(shù)對(duì)疑似病料進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)二者檢測(cè)結(jié)果比較后認(rèn)為，前者雜質(zhì)較多，成像不清晰，而后者則簡(jiǎn)單快速，敏感特異，而且可以對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行定位。阿留申病毒能在睪丸細(xì)胞和腎細(xì)胞、鼠和雞胚等原代細(xì)胞上生長(zhǎng)，也可在貓腎細(xì)胞上繁殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變。但病原學(xué)的檢測(cè)多用于實(shí)驗(yàn)研究，很少應(yīng)用于臨床。

4．2 血清學(xué)檢查

目前在水貂阿留申病研究的檢疫技術(shù)中以血清學(xué)診斷尤為重要。

4．2．1 碘凝集試驗(yàn)(IAT) 該方法是根據(jù)病貂血清中γ－球蛋白顯著增多，遇到碘試劑可以發(fā)生凝集反應(yīng)的原理而設(shè)計(jì)的。但該方法特異性差，結(jié)核病及其他肝腎疾病均呈現(xiàn)陽性，因此該法始終未能普及。

4．2．2 對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)(CIEP) 該方法是利用特異性阿留申病毒抗原(組織抗原或細(xì)胞抗原)能與被檢水貂血清中抗體進(jìn)行反應(yīng)的原理設(shè)計(jì)的。在電場(chǎng)力作用下，抗原由陰極向陽極遷移，而抗體則反向運(yùn)動(dòng)，在瓊脂糖凝膠中抗原和抗體結(jié)合成清晰的灰白色沉淀線則證明為陽性。

4．2．3 淋巴細(xì)胞酯酶標(biāo)記 林學(xué)岷等［12］采用ANHE染色法對(duì)健康貂和患病貂做了T，B淋巴細(xì)胞的測(cè)定試驗(yàn)。結(jié)果表明，AD水貂的T，B淋巴細(xì)胞與健康水貂的T，B淋巴細(xì)胞值差異明顯，T淋巴細(xì)胞明顯降低。據(jù)B．Aasted等［13］報(bào)道，B淋巴細(xì)胞呈ADV的最初靶細(xì)胞，使ADV復(fù)制進(jìn)入轉(zhuǎn)化階段，致使感染的B淋巴細(xì)胞大量增生和分化。因此，淋巴細(xì)胞酯酶標(biāo)記可作為水貂的ADV早期診斷的可靠方法。但此法目前尚未推廣使用。

4．2．4 膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細(xì)管作用原理，以膠體金為標(biāo)記物來顯示結(jié)果的一種新型的檢測(cè)技術(shù)。徐磊［14］通過水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原區(qū)的原核表達(dá)產(chǎn)生的抗原作為標(biāo)記抗原，初步建立了水貂阿留申病膠體金層析診斷方法，并與對(duì)流免疫電泳法進(jìn)行了比較，顯示了較好的敏感性和特異性。

除上述幾種方法外，水貂阿留申病的血清學(xué)診斷還有間接免疫熒光試驗(yàn)法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，但因操作方法均較復(fù)雜，尚未用于獸醫(yī)臨床實(shí)踐。

4．3 分子生物學(xué)診斷

4．3．1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR技術(shù)是利用特異性的引物對(duì)靶序列進(jìn)行體外擴(kuò)增的一種方法，該技術(shù)從理論上可對(duì)微量(最少可為1個(gè)核酸拷貝)的靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性遠(yuǎn)超過CIEP方法。對(duì)于母貂分娩時(shí)可能出現(xiàn)的死胎、木乃伊胎或剛出生的幼仔，由于很難獲得血清樣品及可能存在的其它一些干擾因素，在實(shí)驗(yàn)室診斷中不能使用CIEP進(jìn)行ADV抗體檢測(cè)，但PCR方法可以完成這一檢測(cè)工作。

由于PCR檢測(cè)成本較高等因素的限制，用于ADV感染情況檢測(cè)的樣本數(shù)不夠大，檢測(cè)的結(jié)果并不一定能夠十分準(zhǔn)確地反映一個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖水貂ADV感染的實(shí)際情況，僅可以對(duì)國(guó)內(nèi)水貂ADV感染情況的嚴(yán)重性給以一定的參考。

4．3．2 基因檢測(cè)芯片 朱善元等［15］根據(jù)已發(fā)表的水貂阿留申病病毒的序列，在現(xiàn)有的探針反相雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，融合基因芯片的基本原理和核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，制作成疾病診斷基因芯片。結(jié)果表明，基因芯片的檢出率比ELISA方法高17%。該方法可克服ELISA法和碘凝集方法需要制備新鮮血清和敏感性差等問題;可在機(jī)體產(chǎn)生抗體之前，早期準(zhǔn)確地檢測(cè)病原，這對(duì)預(yù)防、控制水貂阿留申病疫情的蔓延十分有利;由于在每份檢測(cè)樣品中都設(shè)立了陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，可有效地克服PCR易被污染的缺點(diǎn)?；蛐酒椒梢宰鳛殍b別水貂阿留申病的一種新途徑。

5 防 治

阿留申病毒對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)是一種嚴(yán)重的威脅，但是基于疫苗的保護(hù)性控制的研究嘗試始終沒有取得成功。因ADV的特殊的致病機(jī)理，其疫苗的研制開發(fā)一直是動(dòng)物醫(yī)學(xué)界很棘手的問題。ADV感染水貂后，水貂體內(nèi)不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的中和抗體，而產(chǎn)生的多數(shù)抗體不僅不能中和病毒的毒力，反而通過介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用，進(jìn)一步幫助ADV對(duì)靶細(xì)胞的侵染。由于病毒抗原與抗體形成的復(fù)合物特有的理化特點(diǎn)可導(dǎo)致免疫復(fù)合物逃避巨噬細(xì)胞的吞噬而沉積并引發(fā)腎小球腎炎和動(dòng)脈炎。這些都對(duì)基于病毒粒子構(gòu)建疫苗帶來了許多的困難。

近些年DNA疫苗又成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，其原理是將編碼引起免疫應(yīng)答的目的基因片段插入質(zhì)粒載體中，然后將重組質(zhì)粒直接導(dǎo)入機(jī)體，它通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)目的抗原，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。它能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，疫苗穩(wěn)定，對(duì)保存溫度要求不高，基因疫苗較之傳統(tǒng)疫苗顯示出了許多優(yōu)點(diǎn)。

基于以上優(yōu)點(diǎn)，有人嘗試構(gòu)建了NSl基因的DNA疫苗并檢驗(yàn)了對(duì)ADV的保護(hù)作用。結(jié)果表明，將NSl的DNA疫苗與NSl蛋白疫苗配合同時(shí)免疫動(dòng)物能起到部分保護(hù)作用［16］?；谝陨显?，要想通過研制疫苗有效預(yù)防AD還有待時(shí)日。

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