流式細胞術在高等植物細胞學研究中的應用＊

姜倩倩，曹 慧

（濰坊學院，山東 濰坊 261061）

流式細胞術在高等植物細胞學研究中的應用＊

姜倩倩，曹 慧

（濰坊學院，山東 濰坊 261061）

流式細胞術作為一種快速、靈敏的細胞分析技術，目前已廣泛應用于細胞生物學、發(fā)育生物學、細胞動力學、分子生物學等植物學研究的多個領域。本文簡要論述了流式細胞儀的工作原理，并對其在高等植物細胞學研究中的應用做了綜述。

流式細胞術；細胞核；染色體；細胞凋亡

流式細胞儀（Flow Cytometer）是一項集激光技術、光電測量技術、計算機技術、電子物理、流體力學、細胞免疫熒光化學技術以及單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。它的研制、發(fā)展、革新和應用領域的擴展是由生物學、生物技術、計算機科學、電子工程學、流體力學、激光技術、分子生物學、有機化學和物理學等多個學科綜合發(fā)展和應用而實現(xiàn)的［1］。流式細胞術（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀對生物顆粒（細胞、細胞器、微生物）的多種物理和生物學特性進行定量分析，并可根據(jù)測量的參數(shù)，同時將測量群體中的一個或兩個亞群加以分選的細胞分析測量技術，具有操作簡單、分析精確、重復性好、費用低廉、分析速度快等優(yōu)點。

FCM在醫(yī)學臨床方面的應用較為廣泛，如腫瘤學、免疫學、血液學及臨床檢驗等，并拓展到生物學的各個領域，如細胞生物學、細胞遺傳學、分子生物學、神經(jīng)生物學、微生物學，分子免役學，生物化學等。FCM在植物中尤其是高等植物中的應用較晚，直到20世紀80年代中期才開始，主要是適合流式細胞分析的植物單細胞懸液制備比較困難。FCM要求所提供的樣本必須是完整的細胞或細胞核的懸浮液，由于植物細胞不同于動物細胞，除了具有細胞壁外，植物細胞中還含有大量次生代謝物，這就給制備樣本增加了難度，大大降低了流式實驗的成功率。自從Dolezel等［2］發(fā)現(xiàn)利用植物根尖分裂組織或者幼嫩葉片較易獲得合適的單細胞懸液后，F(xiàn)CM在植物學研究方面得到了廣泛應用，其中細胞核DNA分析、倍性分析、染色體結構分析、細胞周期分析等方面是其應用最廣泛的領域。

1 流式細胞儀的工作原理

待測細胞被制備成單個細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料標記后，在氣體壓力下，以一定速度進入流動室。流動室內(nèi)充滿了同軸方向流動的鞘液，樣品在鞘液的約束下，細胞呈單個排列形成液柱以均等的時間依次通過流動室的噴嘴，然后從噴嘴噴出進入檢測區(qū)。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光，分別由聚光系統(tǒng)中的不同濾光片收集并送到檢測器上。用于FCM的檢測器主要有硅光電二極管和光電倍增管。硅光電二極管適合于強光的檢測，常用于前向角散射光（FSC）的測量。光電倍增管適合于弱光的檢測，常用于熒光及側向角散射光（SSC）的檢測。檢測器將進入的光信號轉變?yōu)殡娦盘柡螅?jīng)模擬數(shù)字（A／V）轉換器轉換為數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機分析后，細胞的一系列重要物理化學特性就被快速、大量地測定出來［3－4］。

此外，流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取，它是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體，可以產(chǎn)生高頻振蕩，產(chǎn)生同頻機械振動，流動室也隨之振動，因此液流斷裂為均勻的液滴，其形成速度與振動頻率有關，待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷，當帶電液滴通過電場，在電場的作用下發(fā)生偏轉，然后落入相應的收集器之中，從而實現(xiàn)細胞分選。

2 流式細胞儀在植物細胞學研究中的應用

2.1 識別和分揀植物染色體

1984年，De Laat和Blass［5］第一次報道了流式細胞技術識別和分揀植物染色體。他們制備了模式植物纖細單冠菊的完整染色體懸浮液，通過流式細胞術分離了2種染色體類型。隨后，流式細胞技術被廣泛應用于植物染色體研究中，目前已對數(shù)十種植物種類進行了染色體分析，其中豆類及禾谷類作物應用最多。

識別和分揀染色體的流式細胞儀是專門帶有分揀設備的流式細胞儀，也叫熒光激活流式細胞分揀儀，分析的樣品是染色體懸浮液，分離和分選的對象是中期染色體或染色體的部分，是亞細胞水平的技術操作。其原理是有絲分裂中期細胞去細胞壁后制成特異性熒光染色的染色體懸浮液，作為樣品加入到流式細胞儀并形成狹窄的液流按一定順序高速通過光學檢測系統(tǒng)的高強度光束，已染色的染色體產(chǎn)生的熒光被量化，進而根據(jù)染色體大小、形態(tài)和相對熒光強度對染色體進行分類分析。通過把高速液流截斷成液滴，帶電荷的含有所需染色體的液滴經(jīng)過靜電場會偏離液流，從而分離和純化單個染色體［6］。傳統(tǒng)的熒光染色方法是用1－2種DNA熒光染料對染色體懸浮液進行染色，相對的熒光強度分布分別以單參數(shù)和雙參數(shù)流式核型顯示［7］。理想的話，每個染色體應以較分散的峰面被區(qū)別出來。但實際分揀時，由于許多種植物的染色體大小差異較小，只能在其流式核型分析圖中形成一個復合峰，若僅通過流式分揀，尚不能達到分揀單條染色體的水平。此外，由于植物染色體懸浮液濃度低，染色體篩選的速度受到嚴重影響。因此，制備好的染色體懸浮液是應用流式分析的關鍵。

被FCM分選出來的植物染色體可被篩選到尼龍濾紙、顯微鏡玻片、PCR試管或其他試管。單條染色體分揀能將基因組化整為零，克服了基因組過大難以分析的困難，提高特定染色體片段和特定基因分離和研究的效率；另外在克隆之前，通過分割基因組可以大大減少文庫篩選；分揀的染色體的形態(tài)可以得到良好的保持，具有廣泛的應用范圍和廣闊的發(fā)展前景。其中，就可應用FCM分選出活的原生質(zhì)體，并通過分選出來的原生質(zhì)體再生出植株，其中最有意義的就是選出由原生質(zhì)體融合所產(chǎn)生的異核體。劉繼紅等［8］采用流式細胞術，對酸橙（Citrus aurantium L）葉肉原生質(zhì)體和甜橙（C sineniscv Shamouti）胚性愈傷組織原生質(zhì)體電融合后再生的體細胞雜種進行分析，發(fā)現(xiàn)所有的體細胞雜種植株熒光強度是二倍體對照的兩倍，這說明兩者的原生質(zhì)體已經(jīng)融合?？梢苑诌x出來用于新品種的培育。

2.2 測定植物細胞核DNA含量

1983年，Galbraith運用流式細胞術成功測定了17種植物的核DNA含量，為運用流式細胞術檢測植物核DNA含量的研究開創(chuàng)了先河。DNA與其熒光染料如PI（碘化丙啶）、EB（溴化乙啶）、HO33342、HO33258、DAPI（4’6－二脒基二苯基吲哚）和AO（吖啶橙）等定量結合后，經(jīng)激光照射發(fā)出特異熒光。在同一條件下，經(jīng)熒光試劑處理的細胞核內(nèi)DNA分子數(shù)目越多，這些DNA促發(fā)熒光的強度也就越強，直接反映細胞核DNA含量的高低。

理論上，在細胞分裂時，隨著染色體數(shù)目的成倍增加，細胞核DNA含量成倍增加，檢測到的熒光強度也必然成倍增加。細胞核DNA相對含量的高低與細胞的倍性密切相關，根據(jù)細胞核DNA含量的高低可進行倍性鑒定。倍性鑒定的方法一直是多倍體研究的重要內(nèi)容之一，染色體計數(shù)法雖然準確性高，但操作復雜，用于大量材料的倍性鑒定仍相當困難，而利用細胞學特征進行倍性鑒定雖然易于進行，但鑒定的準確性有待于提高。近年來，F(xiàn)CM開始用于植物細胞核DNA含量的研究，目前已對柑橘［9］、葡萄［10］、大白菜［11］及菊花［12］等進行過研究。這些研究表明，利用FCM測定細胞核DNA的相對含量是一條快速方便，且準確性高的鑒定植物染色體倍性的途徑。

用流式細胞儀進行倍性分析時，常用DNA的絕對含量或相對含量來進行分析。如果要測量DNA的絕對含量，就必須設一個標準的樣品，來換算出DNA的絕對含量。通常用已知細胞核DNA含量的雞血紅細胞核作測量標準。付改蘭和馮玉龍［13］利用流式細胞儀鑒定多種雜草倍性時，就是以已知細胞核DNA含量的雞血紅細胞核作測量標準。測定DNA的相對含量時，選擇一個已知倍性的同類材料作對照，所有待檢測的樣品均與其作比較，即可換算出待檢樣品的DNA相對含量，并對其進行倍性分析。2005年日本Kulthinee等［14］用已知DNA含量的大麥品種做對照，使用流式細胞儀鑒定多種獼猴桃品種的倍性。

2.3 分析植物細胞周期

應用FCM計算測量植物細胞核內(nèi)DNA含量以及鑒定染色體倍性實際上是細胞周期的測量。流式細胞儀對單個細胞內(nèi)DNA含量進行分析時，通過標記物發(fā)出熒光的強弱可推算出G0、G1期（二倍體）、S期（超二倍體）、G2、M期（四倍體）的比例，其結果以DNA分布的直方圖的形式顯示，進而可由G0／G1，S／G2＋M比率來了解細胞的增殖能力，并可了解細胞的增殖狀態(tài)。［15］

2.4 檢測植物凋亡細胞

細胞凋亡（Apoptosis），又稱細胞程序性死亡，是由基因控制的細胞自主性的有序的死亡過程，是生物體生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的正?，F(xiàn)象，在生物體形態(tài)構成、正常細胞更替以及維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要作用。FCM檢測凋亡細胞的方法包括三個方面。

2.4.1 形態(tài)學檢測

在FCM檢測時，前向散射光（FSC）的強度與細胞大小有關，而側向散射光（SSC）的強度與質(zhì)膜和細胞內(nèi)部的折射率有關。細胞凋亡時，細胞膜皺縮，胞漿濃縮，體積變小，細胞內(nèi)顆粒往往增多，所以凋亡細胞的典型特征是前向角散射下降和側向角散射升高。［16］

2.4.2 細胞DNA含量的檢測

在凋亡細胞內(nèi)，由于細胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內(nèi)的總DNA含量下降，利用FCM檢測細胞的DNA含量可以形成直方圖，如果在直方圖上二倍體細胞峰的左方出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰就說明存在細胞凋亡，并且通過測定凋亡峰的高度可以確定凋亡細胞的比例。［17］

2.4.3 DNA斷裂點標記法

細胞凋亡的最后階段是形成DNA片段，DNA斷裂點法檢測的即是DNA的斷裂片段，即標記DNA斷裂的3′－羥基末端，常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口轉移（in situ nick translation，ISNT）或用Td T介導的d UTP原位缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end labeling，TUNEL）技術，兩者均可進行間接或直接標記。間接標記物常為生物素化脫氧三磷酸尿苷（biotin－d UTP）或地高辛配體（Dig）－d UTP等，此外還需要連霉親和素或抗Dig－d UTP，使標記反應增倍，提高靈敏度；直接標記的標記物常為異硫氰酸熒光素（FITC）－d UTP。［18－19］

3 結束語

近年來，F(xiàn)CM作為一種日漸成熟的技術，已經(jīng)深入到植物研究的諸多領域，給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學研究提供了一個強有力的工具。目前，利用FCM不但可以對植物細胞進行計數(shù)、測量基因組大小，還能分析細胞周期、鑒定核型（染色體的DNA含量）、分揀染色體以及構建染色體文庫等。FCM作為一種生物檢測技術已經(jīng)日臻完善，儀器的硬件平臺也已達到穩(wěn)定的技術狀態(tài)。但是，這種技術還有一些自身的缺點，如價格昂貴、對操作人員要求高以及樣品需要復雜的前處理等，這都限制了流式細胞術在植物領域中的應用?？茖W家和儀器制造商又紛紛將研究的焦點轉向熒光染料的開發(fā)、單克隆抗體技術、細胞的制備方法以及提高電子信號的處理能力上來，以拓展FCM日趨廣泛的應用領域。我們相信流式細胞術作為一種不斷完善的技術在植物學研究中將有更加廣闊的應用前景。

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（責任編輯：肖恩忠）

Applications of Flow Cytometry in the Study of Higher Plant Cytology

JIANG Qian－qian，CAO Hui
（Weifang University，Weifang 261061，China）

In this paper，the foundational characteristics of the flow cytometry were briefly described，and its applications in the study of higher plant cytology，including cell nuclei，protoplast，chromosome，and cell apoptosis were elaborated.

flow cytometry，cell nuclei，chromosome，cell apoptosis

2011－07－24

姜倩倩（1983－），女，山東泰安人，濰坊學院生物工程學院講師，博士。研究方向：果樹生理與分子生物學。

S601 文獻標識碼：A 文章編號：1671－4288（2011）06－0082－04