豬胸膜放線桿菌中黏附素的研究進(jìn)展

計(jì) 群,謝 芳,周 靚,王 瑜,楊舒心,李林溪,韓文瑜,雷連成

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)對豬肺上皮細(xì)胞的黏附是引發(fā)感染的第一步,是病原菌定植、生存和增殖的必要而又極其關(guān)鍵的過程。處于黏附狀態(tài)的病原菌能夠增強(qiáng)其對宿主的毒性作用,從而提高其對不利因素的抵抗力,并增強(qiáng)攫取營養(yǎng)的能力[2]。黏附素通常是位于 APP菌特定部位的一種蛋白,APP以這些黏附結(jié)構(gòu)物質(zhì)作為配體,與宿主細(xì)胞的表面受體相互作用,介導(dǎo)黏附作用的發(fā)生。為了與豬肺上皮細(xì)胞的特異性受體發(fā)生相互作用,黏附素必須被遞呈至菌體表面。實(shí)驗(yàn)研究過程中可通過破碎菌體獲得黏附素蛋白,通過研究其與豬肺上皮細(xì)胞的特定黏附作用探究疫苗開發(fā)的潛力。

1 自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素概述

APP屬于革蘭氏陰性菌,這類菌具有不同的蛋白分泌系統(tǒng),而 V型分泌系統(tǒng)是其中最簡單的分泌系統(tǒng),經(jīng)該系統(tǒng)分泌的多肽是通過位于外膜上的某個特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而分泌的。當(dāng)這兩個多肽不同時分泌時,它們就構(gòu)成了雙伴侶分泌系統(tǒng)(Two-partner secretion system,TPs)。但當(dāng)這兩個多肽融合為一個蛋白時,就稱為自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Autotransporter protein)[3]。目前,已發(fā)現(xiàn)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有 700多種,它們是一類含有多種功能的家族蛋白,如黏附、侵入、蛋白水解活性、細(xì)胞毒性、血清抗性(Serum resistance)和細(xì)胞間播散(Cell-to-cell spread)等功能[4]。其中,自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素(Autotransporter adhesin)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種增強(qiáng)致病菌感染致病的重要毒力因子,引起了國外研究者的關(guān)注[5]。

研究發(fā)現(xiàn),自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分子結(jié)構(gòu)與分泌過程的基因序列排布具有典型的特征。自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的結(jié)構(gòu)主要包含 N末端信號肽(Signal peptide)、中間的承載結(jié)構(gòu)域(Passenger domain)和 C末端的轉(zhuǎn)運(yùn)單位(Translocation unit)。其中,承載結(jié)構(gòu)域是決定自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素功能的區(qū)域[6]。其分泌的主要步驟是:第 1步,自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素通過 sec內(nèi)膜分泌系統(tǒng)穿過內(nèi)膜,此時 N末端信號肽被脫去;第 2步,轉(zhuǎn)運(yùn)單位形成 β折疊桶結(jié)構(gòu),插入外膜;第 3步,借助轉(zhuǎn)運(yùn)單位使承載結(jié)構(gòu)域穿越到外膜外[6]。

2 自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分類與結(jié)構(gòu)

自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分為 2種:傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素(Conventional autotransporter adhesins)和近年來新發(fā)現(xiàn)的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素(Trimeric autotransporteradhesins,TAAs)。傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的轉(zhuǎn)運(yùn)單位含大約 300個氨基酸,對其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)單位是由 12個 β折疊構(gòu)成一個 β折疊桶,并且有一個α-螺旋將其與承載結(jié)構(gòu)域隔開 。而 TAAs的轉(zhuǎn)運(yùn)單位非常短,大約 70個氨基酸,推測只有4個 β折疊。并且 TAAs是以三聚體的形式存在,因此功能性的轉(zhuǎn)運(yùn)單位也是由 12個 β折疊構(gòu)成,它的每個單體由4個 β折疊組成。由于 TAAs的承載結(jié)構(gòu)域也折疊成三聚體,這種自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的亞家族被稱為“三聚體”自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素。傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有的一個明顯的特征就是承載結(jié)構(gòu)域 C末端的一段區(qū)域?qū)τ诔休d結(jié)構(gòu)域的有效轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊具有著重要的意義[7]。在轉(zhuǎn)運(yùn)時或轉(zhuǎn)運(yùn)后,此段區(qū)域扮演著分子內(nèi)伴侶的角色,調(diào)節(jié)著承載結(jié)構(gòu)域的折疊,因此這個區(qū)域被稱為“自伴侶”[1]。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素缺少這一“自伴侶”區(qū)域。研究者認(rèn)為三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素不需要此區(qū)域,是由于承載結(jié)構(gòu)域可以有效地啟動折疊,可以發(fā)生自我折疊。此外,所有傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的承載結(jié)構(gòu)域是從轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域切割開的,以非共價形式結(jié)合在細(xì)菌表面或者直接釋放到細(xì)胞外。近來的研究還認(rèn)為,相對于傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素,TAAs是以三聚體的形式與宿主細(xì)胞相互作用,具有更高的親和力,這對于克服宿主的機(jī)械力并更穩(wěn)定地黏附具有十分重要的作用。因此,TAAs更被認(rèn)為是一種十分重要的毒力因子,具有潛在的研究應(yīng)用價值。目前研究的 TAAs主要包括:小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的 YadA;腦膜炎奈瑟菌的 NadA黏膜炎莫拉菌的UspA1和 A2;流感嗜血桿菌的 Hia和 Hsf;巴爾通體的 BadA[6]。

3 自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素功能及特征

自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有黏附作用,并且研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的受體與一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有關(guān),如膠原蛋白、纖維結(jié)合蛋白。然而,尚不能精確地確定自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素中負(fù)責(zé)黏附的結(jié)合區(qū)域,目前主要通過對黏附蛋白基因片段的酶切表達(dá)來探究其黏附部位,但一些承載結(jié)構(gòu)域的基序已經(jīng)證明與黏附素有關(guān)。例如,已經(jīng)證實(shí)了含有 Arg-Gly-Asp(RGD)序列的承載結(jié)構(gòu)域與黏附作用的發(fā)生密切相關(guān)。百日咳桿菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素pertactin(Prn)含有RGD序列,并且在 Prn與上皮細(xì)胞的黏附中起著重要的作用[8]。其他的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素也具有 RGD序列,如大腸桿菌的 Ag43和百日咳桿菌 BrkA。然而,由于許多自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有 RGD序列,但不具有黏附功能,因此 RGD序列是否具有黏附作用至今仍存在爭議。此外,一些自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素含有重復(fù)氨基酸序列,這些序列可以代表結(jié)合位點(diǎn)。例如,富含脯氨酸的區(qū)域(PRR)經(jīng)常出現(xiàn)在自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素中,如腦膜炎奈瑟(氏)菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 App含有 6個重復(fù)的Pro-Gin序列[9],Prn含有 5個重復(fù)的 Pro-GIn-Pro序列[10],立克次體的 rOMPA蛋白,含有 12個不完全重復(fù)序列,每個序列含有 70～75個氨基酸,這屬于較長的重復(fù)序列[11]。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素也發(fā)現(xiàn)含有大量重復(fù)序列。例如,YadA有 8個 Ser-Val-Ala-Ile-Gly-X-X-Ser重復(fù)序列[12]。相同位點(diǎn)的重復(fù)有利于同時與多個受體結(jié)合,或者一些相同的結(jié)合位點(diǎn)與同一受體分子結(jié)合,都可以提高自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素與受體結(jié)合的親和力[13]。許多自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素還介導(dǎo)細(xì)菌自身凝集和生物膜形成,大多數(shù)情況下,這種現(xiàn)象的發(fā)生是由于兩個臨近細(xì)菌的承載結(jié)構(gòu)域相互作用或者其中一個細(xì)菌的承載結(jié)構(gòu)域與另一個細(xì)菌的其它表面蛋白相互作用。AIDA和 Ag43是大腸桿菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素,高表達(dá)的大腸桿菌菌株具有顯著的凝集現(xiàn)象,說明 AIDA和 Ag43可以相互作用,促進(jìn)細(xì)菌凝集[14]。此外,許多自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素還具有其它活性,是多功能蛋白。有一些自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素表現(xiàn)出蛋白水解活性。很多時候,這種蛋白水解活性包括自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素自身水解的過程。如大腸桿菌的溫度敏感型血凝素也具有血紅蛋白酶解作用[15]。此外,自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素也表現(xiàn)出侵入性,或者可以結(jié)合宿主血清蛋白,起到抵抗血清殺菌活性和吞噬作用。近來還發(fā)現(xiàn),黏膜炎莫拉菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 McaP不僅可以黏附上皮細(xì)胞,還具有酯酶和磷脂酶活性[16]。

4 自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素研究前景

自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素在細(xì)菌黏附宿主的過程中發(fā)揮主要作用,因此,通過研究黏附素蛋白與機(jī)體的免疫作用機(jī)制開發(fā)疫苗成為黏附素的重要應(yīng)用方向。通過基因敲除方法去除特定的表達(dá)蛋白基因片段,研究特定的蛋白區(qū)域與細(xì)胞的結(jié)合狀況來開發(fā)疫苗將成為一個好的應(yīng)用途徑。

隨著對一些病原菌自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的認(rèn)識和深入研究,發(fā)現(xiàn)許多自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有免疫保護(hù)作用,有的還以自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素為主要成分成功開發(fā)出商品化疫苗。自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種疫苗使用的最成功的例子是自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 pertactin。百日咳桿菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 pertactin(PRN)已經(jīng)作為一種疫苗組分添加到商品化的五價無細(xì)胞百日咳疫苗中[17]。并且產(chǎn)生抗體水平較高的 pertactin是疫苗發(fā)揮作用、減低百日咳感染的最有效的因素。隨后英國學(xué)者M(jìn)ar在 2008年用百日咳桿菌的另一個自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素BrkA免疫小鼠,用強(qiáng)毒株攻毒,證實(shí)了 BrkA與自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 pertactin具有相同的免疫保護(hù)作用 。非典型性流感嗜血桿菌(NTH1)的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 Hap和 Hia也是潛在的疫苗靶位。Hap的承載結(jié)構(gòu)域具有免疫原性,免疫小鼠能獲得較高的抗體效價并且具有免疫保護(hù)作用[19]。而 Hia不僅具有較高的免疫性,還具有調(diào)理吞噬作用,進(jìn)一步說明 Hia可以作為防御 NTH1感染的有效疫苗[20]。此外,還在許多致病菌上發(fā)現(xiàn)自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的免疫預(yù)防作用。如2009年,Daigneault等報道了溶血性曼氏桿菌分離株 A1的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 AhsA具有免疫性,并且 AhsA抗體可以抑制其黏附能力,是疫苗研究的候選靶位[21]。

5 展 望

自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列多樣性極大地豐富了自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,使之成為革蘭氏陰性菌的分泌蛋白中最大的家族。目前對自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素越來越多的研究表明,病原菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有多種功能,包括黏附,聚集,生物膜形成和抗宿主防御,是病原菌重要的毒力因子。甚至一些自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素是免疫保護(hù)的關(guān)鍵靶位,有望成為防御細(xì)菌感染的新的疫苗候選。目前,國外研究者僅對少數(shù)病原菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素在分子水平上進(jìn)行了鑒定,并發(fā)現(xiàn)了其功能與毒性的關(guān)系。今后的研究應(yīng)深入了解自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素家族與毒力相關(guān)的性質(zhì),并且闡明它們在宿主相互作用的地位。此外,對已經(jīng)測序完成的革蘭氏陰性菌的基因組的分析還發(fā)現(xiàn),許多 ORFs的編碼蛋白含有自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白區(qū)域。大部分這些假定的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并沒有進(jìn)行鑒定,是否具有黏附活性及其對宿主是否具有毒力有待于進(jìn)一步研究,而自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素是否可以成為一種有效的預(yù)防疾病疫苗的新靶位也需要進(jìn)一步確定。目前豬傳染性胸膜肺炎的疫苗主要是弱毒苗、菌影疫苗、基因疫苗、傳統(tǒng)滅活苗、異源疫苗,由于 APP交叉保護(hù)性很弱,所以這類疫苗有各自缺點(diǎn)。通過對 APP中黏附素結(jié)構(gòu)的研究,著手于 APP粘附宿主的第一步,探究其作用機(jī)理和免疫源性,從而為疫苗的研制和開發(fā)提供基礎(chǔ)和良好平臺。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)