1.9 ?分辨率μ-crystallin蛋白晶體結(jié)構(gòu)及其酮亞胺還原酶活性位點(diǎn)分析

許新磊 李 健 孫麗華 徐春艷 何建華

(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)

3, 5, 3′-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)在細(xì)胞分化、新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用。甲狀腺分泌的 T3通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞[1]，在細(xì)胞質(zhì)中與結(jié)合蛋白結(jié)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞核受體作用，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄[2,3]。Hamada等[4]證明了細(xì)胞質(zhì)可溶部分中存在特異的T3結(jié)合蛋白。Kobayashi等[5]從鼠肝臟純化的細(xì)胞質(zhì)蛋白 CTBP具有依賴NADPH的T3結(jié)合活性。Vie等[6,7]通過蛋白質(zhì)序列分析證實(shí)人源 CTBP(p38CTBP)為 μ-crystallin (CRYM)。CRYM為種屬特異性蛋白，尤其在袋鼠晶狀體中大量表達(dá)[8]，亦在人視網(wǎng)膜、腦、心臟、腎臟表達(dá)。

CRYM具有將 T3保持在細(xì)胞內(nèi)的作用[9]?，F(xiàn)已報(bào)道與nonsyndromic deafness有關(guān)的CRYM基因的兩種突變—K314T和X315Y[10]，K314T突變被確認(rèn)失去了T3結(jié)合能力[11]。CRYM在面肩胛肱肌營養(yǎng)不良癥(FSHD)病人肌肉中大量表達(dá)，F(xiàn)SHD常伴隨視網(wǎng)膜脈管異常，聽力喪失、心律不齊，表明CRYM具有影響分化和氧化應(yīng)激反應(yīng)的功能[12]。CRYM 在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎中具有次要的作用并在人前列腺癌受雄激素調(diào)控高表達(dá)[13,14]。Hallen等[15]通過MS/MS確認(rèn)哺乳動(dòng)物前腦酮亞胺還原酶為 μ-crystallin，并具有酮亞胺還原酶活性，含硫環(huán)形酮亞胺具有影響神經(jīng)功能的生物學(xué)活性[16]。結(jié)果表明CRYM除了具有NADPH依賴的甲狀腺素結(jié)合能力，更有可能通過其酮亞胺還原酶活性調(diào)節(jié) T3以及其他小分子的活性，進(jìn)而影響多種生理進(jìn)程。

μ-crystallin與NADPH復(fù)合物(2.6 ?分辨率)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析[17]，我們用不同結(jié)晶條件結(jié)晶了μ-crystallin，在上海光源采集1.9 ?分辨率數(shù)據(jù)。分析了2I99結(jié)構(gòu)與同源結(jié)構(gòu)OCD /AlaDH的差異，以及酮亞胺還原酶的活性位點(diǎn)，加深了對CRYM結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 μ-crystallin的表達(dá)純化

蛋白表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)[17]方法并加以改進(jìn)，通過PCR從人腦cDNA庫中克隆CRYM cDNA，構(gòu)建pET22b(+) (Novagen)，純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3)細(xì)胞(Stratagene)。挑取單克隆，50 mL LB培養(yǎng)基加入終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素，37°C、250 r/min培養(yǎng)10 h。轉(zhuǎn)入750 mL LB培養(yǎng)基，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，37°C、250 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD 600為0.6–0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，30°C，200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)，5 h后收集細(xì)菌(6000 r/min、10 min、4°C)。沉淀的細(xì)菌用buffer A(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，200 mmol/L NaCl，5% glycerol)重懸，使用細(xì)胞壓力破碎儀破碎。細(xì)菌破碎后離心(30000 g、30 min、4°C)，收集上清。用buffer A平衡5 mL HisTrap HP親和柱(GE Healthcare)，加上清后使用FPLC洗脫，先用buffer A沖洗，然后用30% buffer B (20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，200 mmol/L NaCl，5%甘油，300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白質(zhì)。收集洗脫峰處的蛋白質(zhì)后用10 kD的超濾管(Millipore)濃縮。進(jìn)一步純化使用分子篩(120 mL HiLoad Superdex75 16/60 column，GE Healthcare)，用 buffer C預(yù)先平衡(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，150 mmol/L NaCl，5% glycerol)，收集洗脫峰處蛋白質(zhì)并濃縮至20 mg/mL，–80°C冷藏備用。

1.2 μ-crystallin晶體衍射數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析

采用氣相擴(kuò)散法結(jié)晶，μ-crystallin蛋白濃度為20 mg/mL，池液為 0.2 mol/L硫酸銨，0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.0，20% PEG3350，1 μL蛋白質(zhì)加入1 μL池液，4°C靜置。

晶體衍射數(shù)據(jù)收集時(shí)防凍劑采用0.2 mol/L 硫酸銨、0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.0、20% PEG3350、20%(V/V)甘油，撈取晶體后用液氮冷凍保存。在上海同步輻射裝置(SSRF)生物大分子線站(BL17U1)收集衍射數(shù)據(jù)，溫度 100 K，探測器使用 ADSC Q315r CCD。收集的衍射數(shù)據(jù)用HKL-2000[18]軟件包進(jìn)行初步處理，采用PHENIX[19]進(jìn)行相位解析和結(jié)構(gòu)修正，用COOT[20]進(jìn)行調(diào)圖，CRYM晶體數(shù)據(jù)及結(jié)構(gòu)修正參數(shù)見表 1，表中括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示最外殼層的相應(yīng)數(shù)值。

表1 人源CRYM數(shù)據(jù)收集與修正參數(shù)Table 1 Statistics for data collection and refinement of human CRYM.

2 結(jié)果與討論

2.1 CRYM晶體結(jié)構(gòu)

人源 CRYM晶體結(jié)構(gòu)一個(gè)不對稱單位由兩個(gè)蛋白質(zhì)分子組成，最終模型包括A鏈A2-A313、B鏈B4-B312，139個(gè)水分子，兩個(gè)NADPH，其中B鏈缺少了81-89位殘基的電子密度，CYRM與2I99結(jié)構(gòu)疊合的 RMSD值為 0.78778 ?。人源CRYM結(jié)構(gòu)可分為二聚化結(jié)構(gòu)域和NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域，二聚化結(jié)構(gòu)域包括殘基2-112和296-312。折疊為6個(gè)反平行β折疊，3個(gè)α螺旋，2個(gè)310螺旋，與2I99相比少一個(gè)短的β折疊和一個(gè)310螺旋，但在βC與βD之間多一個(gè)310螺旋(圖1a和圖1b分別為1.9 ?和2.6 ?分辨率的人源CRYM單體結(jié)構(gòu)，輔因子NADPH以棍狀表示，兩個(gè)結(jié)構(gòu)的不同之處用圓圈標(biāo)出，圖使用PyMOL[21]產(chǎn)生)。結(jié)構(gòu)二聚化結(jié)構(gòu)域的疏水面為二聚化面，另一面包含R47、K75、S91、H92、R119和D299等多個(gè)極性殘基。這些殘基在CRYM家族中均為保守殘基(圖2中蛋白質(zhì)序列分別來源于Homo sapiens(human), Bostaurus (bovine), Musmusculus(mouse), Macropus fuliginosus (Westerngraykangaroo), Xenopuslaevis (Africanclawedfrog)，鳥氨酸環(huán)化脫氨酶(OCD, Archaeoglobusfulgidus)和丙氨酸脫氫酶(AlaDH, Pseudomonasputida)。SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中的訪問號(hào)分別是Q14894、Q2KHX6、O54983、Q28488、Q66KY1、O28608和Q88H32。CRYM的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過軟件 DSSP[22]分析得出，指示在該序列比對的上方。CRYM與AlaDH和OCD分別有30%–40%的序列相似性，相同的氨基酸深色標(biāo)示。酮亞胺酶可能的底物結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)分別用黑色圓形和方塊表示。該序列比對使用軟件 ClustalW[23]和ESPript[24]生成。

CRYM單體中各有一個(gè)NADPH，純化及結(jié)晶過程中沒有添加NADP，但是，解析結(jié)構(gòu)中依然可看到清晰而完整的 NADP電子密度(圖 3)。說明NADPH在CRYM功能發(fā)揮即與T3的結(jié)合及其發(fā)揮酮亞胺還原酶的活性中起著重要作用。

NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含殘基113-295，折疊為一個(gè)Rossmann花樣，而此折疊樣式在NAD/NADP結(jié)合蛋白經(jīng)常出現(xiàn)[25]。與其他二核苷酸結(jié)合蛋白結(jié)合相同，CRYM通過βG與α4之間的Gly富集區(qū)與NADPH的焦磷酸部分結(jié)合，序列為GAGVQA-(143-148位殘基)。焦磷酸部分與V146和Q147主鏈酰胺形成氫鍵(圖4用LIGPLOT[26]產(chǎn)生，其中氫鍵以虛線表示，與NADPH形成疏水作用的殘基以穗狀表示)。Q147在所有μ-cystallin序列中均為保守殘基，可能由于其側(cè)鏈酰胺基與焦磷酸部分相互作用。位于loopEF上的S91同樣與焦磷酸部分有氫鍵作用，同其他Rossmann折疊一樣，有一保守水分子介導(dǎo)了G145主鏈酰胺N與V204主鏈羧基O的相互作用[27]。 R169側(cè)鏈與腺嘌呤環(huán)平行，腺嘌呤與D82、T205和A207形成疏水相互作用，D82、 R169、T205、L206和A207共同作用將NADPH腺嘌呤部分固定，N168、R169、N173與腺嘌呤核糖2′-磷酸基團(tuán)形成氫鍵，此結(jié)構(gòu)域相較 2I99少了兩個(gè)β折疊。通過結(jié)構(gòu)看到，兩個(gè)結(jié)構(gòu)的不同之處均出現(xiàn)在CRYM結(jié)構(gòu)的外側(cè)(圖1)，而不同處的氨基酸序列未顯示保守性，未對整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大的影響。

圖1 1.9 ?人源CRYM與輔因子NADPH的晶體結(jié)構(gòu)與2I99比較Fig.1 Comparison of crystal structure of human CRYM in 1.9 ? with 2I99.

圖2 不同來源CRYM蛋白質(zhì)以及OCD、AlaDH氨基酸序列比較Fig.2 Multiple sequence alignments of the μ-crystallin family.

圖3 NADPH電子密度圖(2F0-FC)Fig.3 Electron density maps (2F0-FC) of the bound NADPH.

2.2 CRYM酮亞胺還原酶活性位點(diǎn)分析

酮亞胺還原酶是以NADH或NADPH為輔因子特異性的還原亞胺鍵的還原酶。酮亞胺還原酶底物為環(huán)亞胺(AECK、P2C、Pyr2C)，NADH/NADPH作為質(zhì)子供體，通過酸堿催化將C4上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到酮亞胺不飽和鍵上[28]，將亞胺還原(圖5a，NADH/ NADPH依賴的酮亞胺還原酶催化的底物類型，AECK、TMA、P2C、L-PA、Pyr2C、L-Pro)。CRYM同源物P.putida OCD(PpOCD)以NADH為輔因子催化L-鳥氨酸轉(zhuǎn)化為L-脯氨酸，這一反應(yīng)的亞胺中間體[29](Pyr2C)與酮亞胺還原酶底物相同(圖5b，鳥氨酸環(huán)化脫氨酶催化鳥氨酸環(huán)化脫氨的立體化學(xué)反應(yīng)機(jī)制)。由于CRYM和PpOCD底物結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，由此我們對CRYM酮亞胺還原酶活性位點(diǎn)進(jìn)行了推測。

根據(jù)CRYM與NADPH間的相互作用對與NADPH相關(guān)的保守氨基酸進(jìn)行了分析，由圖4看出，NADPH煙酰胺部分酰胺極性原子與S292、R119形成氫鍵，S292、R119在μ-crystallin/OCD家族中是識(shí)別NADPH煙酰胺部分的保守氨基酸；μcrystallin中T120羥基氧與煙酰胺C4(3.2?)、T116羥基氧(2.7?)以及R119 NH1(2.9?)形成四面體相互作用，同源結(jié)構(gòu)AlaDH的NAD結(jié)合中T109羥基氧與煙酰胺C4、T105羥基氧以及R108 NH1形成四面體相互作用[30]，同源的PpOCD的NAD結(jié)合中T113羥基氧與煙酰胺C4、T109羥基氧和R112 NH1也形成四面體相互作用[29]。說明μ-cystallin家族中保守殘基T116、R119和 T120可很好定位煙酰胺C4(圖 6a，NADPH煙酰胺環(huán) C4周圍的殘基，C4用星號(hào)標(biāo)出)。NADPH煙酰胺Pro-R面與二聚化結(jié)構(gòu)域之間形成空腔，在空腔對面存在多個(gè)殘基側(cè)鏈--R47、M62、K75、V77、F79、H92、S229、K291、 L293、D299(圖6a)。這些殘基中，除S229和L293為半保守殘基外，其余均為完全保守殘基。

圖4 人源CRYM與輔因子NADPH相互作用示意圖Fig.4 Schematic diagrams of interaction between human CRYM and NADPH.

圖5 酮亞胺還原酶催化反應(yīng)與PpOCD催化反應(yīng)對比Fig.5 Comparison of the reaction catalyzed by ketimine reductase and PpOCD.

圖6 CRYM中NADPH周邊殘基及酮亞胺還原酶活性位點(diǎn)Fig.6 A stereo diagram of residues surrounding the NADPH of CRYM.

在脫氫酶中，底物羧基通常與一個(gè)保守的Arg(或者Lys)相互作用[30]。PpOCD中，鳥氨酸羧基與 R45、K69和 R112相互作用，這三個(gè)殘基在CRYM中為保守殘基(R47、K75、R119)。所以，CRYM中的酮亞胺羧基可能如同PpOCD中一樣與R47、K75、R119三個(gè)殘基形成鹽橋(圖6b，推測的CRYM結(jié)合Pyr2C可能的活性位點(diǎn)，活性殘基下方以橫線標(biāo)出)，我們推測R47、K75和R119為CRYM酮亞胺還原酶結(jié)合位點(diǎn)。這與T3結(jié)合位點(diǎn)相同[17]，說明T3能夠可逆的競爭性抑制酮亞胺酶活性。

NAD或NADPH依賴的酶催化活性位點(diǎn)需要作為質(zhì)子受體或供體的殘基，以實(shí)現(xiàn)輔因子和底物之間的氫轉(zhuǎn)移[31,32]，如組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，在還原反應(yīng)中通常出現(xiàn)的廣義酸殘基為組氨酸[28]。通過序列對比可以看到，PpOCD中，催化L-鳥氨酸轉(zhuǎn)化為 L-脯氨酸的活性殘基 D228、E56，在CRYM中對應(yīng)位置為S229和G60，而這兩個(gè)殘基均非酸堿催化殘基。AlaDH中催化L-Ala分解為丙酮酸鹽與氨的活性殘基K41、R52、K65，在CRYM中被R47、G60、K75取代，G60取代R52破壞了AlaDH中質(zhì)子傳遞鏈，并且在AlaDH起催化作用的兩個(gè)重要水分子在CRYM中并未出現(xiàn)。因此我們認(rèn)為R47、G60、K75和S229并非CRYM酮亞胺還原酶的催化活性位點(diǎn)。

?1-Piperideine-2-carboxylate/?1-Pyrroline-2-carb oxylate Reductase中H54、S53和D194形成酮亞胺還原酶活位點(diǎn)[28]。通過序列比對和結(jié)構(gòu)分析，我們認(rèn)為在μ-crystallin家族中保守的H92最有可能作為催化殘基。H92與煙酰胺C4相距6.0?，S91與H92相距2.7?，D82與S91相距8.1?，這三個(gè)殘基極有可能參與酮亞胺還原反應(yīng)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，所以我們推測D82、S91和H92為CRYM酮亞胺還原酶催化活性位點(diǎn)。

2.3 CRYM B鏈81-89位殘基缺失與其底物結(jié)合關(guān)系

與2I99結(jié)構(gòu)對比，在分辨率更高的情況下，未能捕捉到B鏈81-89位殘基的電子密度，我們推測可能是由于loopEF的柔性，在不同的結(jié)晶條件中堆積不同造成的。2I99結(jié)構(gòu)中Pro90在AB鏈具有不同的構(gòu)象，A鏈中為順式構(gòu)象，而B鏈為反式構(gòu)象，高的b-factor說明其具有很高的柔性。D82、S91、H92處于loopEF上，loopEF的柔性可能與其酮亞胺還原酶功能發(fā)揮有關(guān)。由于loopEF的缺失，結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)兩個(gè)明顯的空腔入口(圖7a，1.9 ?分辨率人源CRYM的B鏈81-89殘基處表面結(jié)構(gòu))，而在2I99只有一個(gè)空腔，NADPH結(jié)合在此空腔(圖7b，2I99結(jié)構(gòu)B鏈81-89位殘基處表面結(jié)構(gòu))。CRYM中出現(xiàn)的空腔1即為輔因子NADPH結(jié)合位點(diǎn)，空腔2可能為底物結(jié)合位點(diǎn)，其中 R47、G60、K75位于空腔2底部。我們推測loopEF的柔性可能與CRYM底物選擇性有關(guān)。

圖7 1.9 ?人源CRYM B鏈NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域表面結(jié)構(gòu)與2I99對比Fig.7 Comparison of the NADPH binding domain of the CRYM chain B in 1.9 ? with 2I99.

3 結(jié)語

CRYM在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)甲狀腺素的重要作用，在多種神經(jīng)病癥中表達(dá)量有所改變[10,12]，其酮亞胺還原酶活性具有改變甲狀腺素在細(xì)胞的濃度以及調(diào)節(jié)激素的功能。酮亞胺還原酶作為參與氨基酸代謝的酶類，揭示CRYM在生物體內(nèi)具有多重作用。CRYM酮亞胺還原酶底物、酶活位點(diǎn)及其調(diào)節(jié)甲狀腺素生理功能的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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