苯磺酸氨氯地平分散片人體生物等效性試驗研究

連柏楊 謝秋紅

苯磺酸氨氯地平(amlodipine besylate)是二氫吡啶類長效鈣離子拮抗劑，通過選擇性抑制血管平滑肌內(nèi)鈣離子通道的內(nèi)流，松弛血管平滑肌，降低外周血管阻力，從而達到降低血壓的目的[1]。在臨床上，主要用于治療高血壓，心絞痛，尤其是自發(fā)性心絞痛[2]。本試驗用HPLC-MS法測定苯磺酸氨氯地平在血漿中的血藥濃度，選擇同類制劑氨氯地平片劑作對照，并評價兩種制劑的人體生物等效性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 方法學(xué)考察與評價

1.1 標準曲線的制備取空白血漿1000 μl，分別加入苯磺酸氨氯地平標準溶液100 μl，制成相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平血漿濃度為0.15、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 ng/ml的系列標準血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理”項下方法操作，每一濃度進行雙樣本分析，并記錄色譜峰面積和圖譜。

由測得的苯磺酸氨氯地平峰面積內(nèi)標物尼莫地平峰面積的比值R對血漿藥物濃度C進行線性回歸分析[3]，用加權(quán)(w=1/χ2)最小二乘法[4]求得標準曲線回歸方程:R=0.2eC-2.8×10-2，r=0.9982。其線性檢測范圍:0.15～16.0 ng/ml，定量下限為0.15 ng/ml(S/N≥3)。

1.2 專屬性氨氯地平和尼莫地平(內(nèi)標物)離子化源為ESI源;檢測方式:正離子檢測;掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)方式，定量分析時的離子反應(yīng)分別為m/z 409→m/z 238(氨氯地平)和m/z 419→m/z 343(內(nèi)標尼莫地平)，其二級全掃描圖和結(jié)構(gòu)見附圖1。

分別取6名健康受試者的空白血漿1000 μl，除不加內(nèi)標外，按“血漿樣品處理”項下方法操作(以甲醇代替內(nèi)標溶液)，進樣5 μl，記錄色譜圖;將一定濃度的苯磺酸氨氯地平標準溶液和內(nèi)標溶液加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖。氨氯地平的保留時間為0.75 min，內(nèi)標尼莫地平的保留時間為1.38 min;取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾血漿中苯磺酸氨氯地平和尼莫地平(內(nèi)標物)的測定。

1.3 萃取回收率、精密度在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml的3個標準系列血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析。同時，另取空白血漿1000 μl，不加苯磺酸氨氯地平系列標準溶液和內(nèi)標溶液，其他按“血漿樣品預(yù)處理”項下的方法操作，取5 ml進樣分析。獲得相應(yīng)的峰面積(三次測定的平均值)，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率[5]。

在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3個標準系列血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果均在要求范圍內(nèi)。

1.4 穩(wěn)定性試驗在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3個標準系列血漿樣品(每濃度3樣本分析)，分別進行室溫下放置8 h、-20℃保存30 d、3個冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示苯磺酸氨氯地平高、中、低3個濃度血漿樣品，在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD＜10%;-20℃保存的苯磺酸氨氯地平血漿樣品在30 d內(nèi)穩(wěn)定，RSD＜15%;苯磺酸氨氯地平血漿樣品經(jīng)過3個冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定，RSD＜10%。

1.5 數(shù)據(jù)處理用DAS2.0軟件處理20名受試者各取血點的HPLC-MS測定結(jié)果，其中Cmax和Tmax取實測值，AUC用梯形面積法計算。對Cmax、AUC、AUC的對數(shù)轉(zhuǎn)換值及Tmax的實測值進行方差分析和雙單側(cè)t檢驗及90%可信限判斷，以AUC:80%～125%和Cmax:70%～143%為判定標準[5]，考察兩制劑是否具有生物等效性。根據(jù)兩制劑中苯磺酸氨氯地平的AUC0-144計算相對生物利用度。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度-時間曲線20名健康受試者單次口服苯磺酸氨氯地平試驗制劑和參比制劑10 mg后的血漿中氨氯地平濃度范圍為0.16～8.6 ng/ml，在本試驗的線性范圍內(nèi)。

2.2 生物等效性苯磺酸氨氯地平分散片試驗制劑的相對生物利用度為(97.6±14.8)%。兩制劑主要藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)配對t檢驗，結(jié)果表明，兩種制劑的藥動學(xué)參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。AUC0-t，Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行藥物間、周期間、個體間的3因素方差分析，雙單側(cè)t檢驗均無顯著性差異。lnAUC0-t，ln Cmax的(1-2α)90%置信區(qū)間為90.8%～102.6%和81.9%～98.3%。結(jié)果表明，兩制劑具有生物等效性。

3 討論

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS/MS)是一種將質(zhì)譜儀作為檢測器的色譜技術(shù)，它將HPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性有機結(jié)合起來，具有樣品處理簡單、快速，方法的專屬性及選擇性均較高等特點。因此，它成為藥物代謝與藥物動力學(xué)研究中強有力的工具，而廣泛應(yīng)用于藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用研究。本試驗結(jié)果表明，應(yīng)用LC/MS/MS法測得的苯磺酸氨氯地平在健康人體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)與已有研究報道基本一致[6，7]。本試驗方法學(xué)驗證結(jié)果顯示，苯磺酸氨氯地平血藥濃度測定的標準曲線的線性范圍為0.15～16.0 ng/ml(r2=0.9982)，苯磺酸氨氯地平血藥濃度測定的最低檢測限度為0.15 ng/ml，日內(nèi)、日間變異系數(shù)以及提取回收率亦均符合生物樣品分析要求，證實了本試驗方法的可靠性與準確性。

[1]許俏紅，楊政.洛活喜的動力學(xué)與臨床應(yīng)用.海峽藥學(xué)，1997，9(3):110-111.

[2]王江紅.苯磺酸氨氯地平片研究新進展.中國藥業(yè)，1998，7(10):39.

[3]SFDA.藥品臨床試驗管理規(guī)范，2003.

[4]鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題.藥物分析雜志，1996，16(5):343-346.

[5]中華人民共和國藥典2005年版附錄ⅩⅨB藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則.化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[6]張孝清，陸宏國，徐玉鳳，等.苯磺酸氨氯地平片相對生物利用度研究.中國新藥雜志，2003，12(10):849-851.

[7]欒燕，張逸凡，陳笑艷，等.氨氯地平在中國受試者體內(nèi)的藥物動力學(xué)及制劑的生物等效性.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2000，17(5):327-380.