阪崎腸桿菌檢測技術(shù)研究進展

熊貞蘭

南昌市灣里區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330004

阪崎腸桿菌（enterobacter sakazakii）曾名黃色陰溝腸桿菌，為腸桿菌科腸桿菌屬的一個種。1980年Farmer等[1]發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌無論是DNA-DNA雜交還是生化反應(yīng)以及產(chǎn)生色素上都有很大區(qū)別，因此建議將其從陰溝腸桿菌中分出來，命名為阪崎腸桿菌。2007年Iversen等[2]通過基因分析認(rèn)為阪崎腸桿菌與腸桿菌屬有較大差異，建議將其單獨成立一個新屬，并將新屬命名為“阪崎克若諾菌”（cronobacter sakazakii）。

1 傳統(tǒng)檢測方法的改進

1.1 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)的阪崎腸桿菌鑒定方法一般是先對樣品增菌，劃線分離獲得單菌落，再進行生化鑒定。阪崎腸桿菌的生化反應(yīng)與陰溝腸桿菌相似，應(yīng)注意區(qū)別。

Aldova等[3]評估了從捷克斯洛伐克分離的73株阪崎腸桿菌吐溫80脂酶的活性，結(jié)果顯示97.3%的菌株含有該酶。Postupa等[4]研究了從奶粉和嬰兒配方粉中分離到的6株阪崎腸桿菌，發(fā)現(xiàn)所有的菌株在25℃和37℃培養(yǎng)7 d后都產(chǎn)生吐溫80脂酶。因此，該酶也是鑒定阪崎腸桿菌的一個重要指標(biāo)。

1.2 分離培養(yǎng)基的改進

美國FDA推薦使用結(jié)晶紫中性紅葡萄糖膽鹽瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）分 離 阪 崎 腸 桿 菌，該 菌 在VRBGA平板上生長成黏液狀、周邊有膽汁酸沉淀的紅色菌落。但Famer等[1]發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌在VRBGA上可長成2種菌落，一種是典型的光滑型菌落，容易被接種環(huán)移動；另一種是干燥型或黏液狀菌落，不容易區(qū)分。Muytijens等[5]研究129株阪崎腸桿菌酶譜時發(fā)現(xiàn)，129株阪崎腸桿菌都有α-D-葡萄糖苷酶活性，而其它的腸桿菌沒有。Farmer等[6]也發(fā)現(xiàn)57株阪崎腸桿菌有53株具有α-D-葡萄糖苷酶活性。因此α-D-葡萄糖苷酶可以作為設(shè)計阪崎腸桿菌選擇培養(yǎng)基的一個工具。

一種方法是把α-D-葡萄糖苷連接上熒光基團然后添加到培養(yǎng)基中，阪崎腸桿菌分解α-D-葡萄糖苷從而釋放出熒光基團，在紫外燈下可以清晰判別。Leuschner等[7]在營養(yǎng)瓊脂上加入4甲基傘形基-α-D-葡萄糖苷，制成阪崎腸桿菌熒光選擇培養(yǎng)基。阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上生長成產(chǎn)黃色素菌落，在紫外燈下有熒光。不動桿菌屬、赫氏埃希氏菌、非脫羧勒克氏菌、聚團腸桿菌等雖然也能在該培養(yǎng)基上產(chǎn)黃色素，但在紫外燈下沒有熒光。阿氏腸桿菌和中間腸桿菌有熒光但不產(chǎn)黃色素。從而能把它們和阪崎腸桿菌區(qū)分開。但也有例外，傷口埃希氏菌在該培養(yǎng)基上有黃色素也有熒光。Oh等[8]做了進一步的改進，在培養(yǎng)基中除了加入4甲基傘形基-α-D-葡萄糖苷外，還添加了膽酸鹽抑制非腸桿菌，加入檸檬酸鐵和硫代硫酸鈉以區(qū)別產(chǎn)H2S的腸桿菌，從而大大提高了選擇效果。

另一種方法是把α-D-葡萄糖苷連接上顯色底物，制成顯色選擇培養(yǎng)基。Restaino等[9]設(shè)計了一種阪崎腸桿菌選擇培養(yǎng)基（ESPM），阪崎腸桿菌在ESPM上35℃培養(yǎng)24 h生長成藍黑色、無光環(huán)、直徑1～2 mm的菌落，其他的腸桿菌生長成白色、黃色、綠色菌落。只有索氏志賀氏菌和一株泛菌屬生長成藍黑色到藍灰色之間的菌落，但很容易通過生化反應(yīng)把它們和阪崎腸桿菌區(qū)分開。該培養(yǎng)基可用于從各種食品中（玉米、小麥、面粉、嬰兒奶粉、乳制品、谷類）和環(huán)境中分離阪崎腸桿菌。趙貴明等[10]在營養(yǎng)瓊脂中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，并添加月桂基硫酸鈉做抑制劑，制成顯色培養(yǎng)基。阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上成藍綠色菌落，其他腸桿菌成白色菌落。但傷口埃希氏菌也生長成藍色菌落，其與阪崎腸桿菌生化差異很大，容易區(qū)分。

2 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種細菌的檢測。PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性好的優(yōu)點，大大縮短了檢測時間。由于對阪崎腸桿菌的基因組了解還不多，用于檢測的靶基因還較少，最常用的一個靶基因是16S rDNA。

Iversen等[11]對126株阪崎腸桿菌進行了16S rDNA測序，序列比對分析發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌與克氏枸櫞酸桿菌的相似度最高，達到97.8%，超過其他任何腸桿菌。其次才是陰溝腸桿菌（97%）、弗勞地枸櫞酸協(xié)桿菌（96%）。對其序列進行聚類分析發(fā)現(xiàn)分成了4族。110株在1族中，第3族包括5株菌，它們在分類地位上更接近于克氏枸櫞酸桿菌、梨褐色葉斑病菌、霍氏腸桿菌，第4族的兩株菌和阪崎腸桿菌典型菌株更是只有96.5%的相似性。這些結(jié)果表明阪崎腸桿菌的基因多樣性和分類學(xué)上的復(fù)雜性。

Lehner等[12]對13株阪崎腸桿菌分離株和ATCC51329的16S rDNA進行了全長測序，序列與GenBank原有的ATCC29544序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株與ATCC29544相似度在99.4%～100.0%，而ATCC51329與ATCC29544只有97.9%的相似性。構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)15株菌呈2個基因族，新測序的14株菌在一個族，ATCC51329單獨在另一個族。

16S rDNA和16S-23S rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列是細菌分類最常用的部位。根據(jù)ITS的長度和序列的變化可以鑒定細菌的種屬。劉寅等[13]對阪崎腸桿菌的ITS進行了測序，并進行了序列比對分析，選擇特異性區(qū)域設(shè)計引物，建立PCR檢測方法，檢測低限達到2.2～5.4 CFU/100 g。隨后，他們又選擇了ITS的G操縱子作為鑒定目標(biāo)序列，建立了實時定量PCR檢測方法。盡管樣品仍然需要預(yù)先增菌過程，但整個檢測時間在2 d內(nèi)即可完成，檢測極限達到1.1 CFU/100 g。由于G操縱子是多拷貝的（4個拷貝）所以針對它的PCR可以提高敏感性。

Seo等[14]針對阪崎腸桿菌的部分大分子合成操縱子：rpsU基因3’端和dnaG基因5’端設(shè)計探針，建立了一個實時PCR檢測方法。經(jīng)68株腸道菌和55株非腸道菌進行特異性評價，結(jié)果顯示特異性很好，檢測極限達到100 CFU/mL。而且該方法不需預(yù)增菌，可直接檢測奶粉樣品，大大節(jié)省了時間。

a-D-葡萄糖苷酶活性是阪崎腸桿菌區(qū)別其他腸桿菌的一個重要特征，已利用這一特點制備了選擇培養(yǎng)基，但選擇培養(yǎng)基存在假陽性的問題。Lehner等[15]應(yīng)用細菌人造染色體技術(shù)（bacterial artificial chromosome, BAC）找到了阪崎腸桿菌中a-D-葡萄糖苷酶活性的分子基礎(chǔ)，建立了以該基因為目標(biāo)的阪崎腸桿菌PCR鑒定方法，經(jīng)63株阪崎腸桿菌分離株和39株其他菌株測試，結(jié)果表明該方法特異性很好。值得注意的是，已經(jīng)知道還有其他的細菌也具有a-D-葡萄糖苷酶活性，并也能在DFI上生長，但Lehner建立的這個以編碼a-D-葡萄糖苷酶的基因為基礎(chǔ)的PCR方法卻沒有出現(xiàn)假陽性問題，這一現(xiàn)象還沒有確切的解釋。

3 其他檢測系統(tǒng)

隨著分子生物學(xué)以及計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的細菌鑒定系統(tǒng)。德國Vermicon公司推出了新產(chǎn)品：VIT細菌鑒定系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用16S rDNA的特異性片斷制備成基因探針，用于檢測食品和飲料中的細菌。阪崎腸桿菌在VIT系統(tǒng)中通過落射熒光顯微鏡觀察呈特征紅色，很容易判斷。檢測極限可達103 cfu/mL。

Iversen等[16]運用人工神經(jīng)智能網(wǎng)絡(luò)（artificial nerual networks，ANNs）技術(shù)建立了阪崎腸桿菌的一種全新的鑒定系統(tǒng)。將細菌的生化譜和16S rDNA序列輸入到系統(tǒng)中，系統(tǒng)可判斷哪些是能用于鑒定的核心生化試驗與DNA序列，為細菌鑒定所選用的特征提供了依據(jù)，降低了假陽性和假陰性的風(fēng)險。用該系統(tǒng)鑒定了282株菌，其中包括189株阪崎腸桿菌和39株其他a-葡萄糖苷酶陽性的菌株。結(jié)果除將2株非阪崎腸桿菌鑒定為阪崎腸桿菌外，其余均正確鑒定，表現(xiàn)了較好的特異性。

雖然阪崎腸桿菌的分離與分子檢測技術(shù)都取得了長足進展，但研究領(lǐng)域和方法還稍顯局限。目前對阪崎腸桿菌的致病機理、免疫反應(yīng)、基因結(jié)構(gòu)等方面還很不清楚。隨著各方面研究的深入，新的分離檢測技術(shù)會相繼出現(xiàn)。

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