電針“百會(huì)、風(fēng)府”穴對(duì)腦I/R損傷大鼠海馬區(qū)CPG15表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究※

● 唐曉敏 秦正玉 何宗寶 王家琳 吳生兵 汪克明

缺血性腦卒中是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧而引起的局限性腦組織的壞死或腦軟化。本病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，源于《內(nèi)經(jīng)》對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)。針灸在治療缺血性腦卒恢復(fù)期的治療中具有優(yōu)勢(shì)，一定程度上提高了缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)［1，2］。電針治療對(duì)缺血再灌注大鼠模型神經(jīng)功能恢復(fù)及海馬區(qū)神經(jīng)可塑性相關(guān)基因15(CPG15，candidate plasticity－related gene 15)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生怎樣影響，CPG15在針刺抗腦缺血損傷中樞神經(jīng)重塑過(guò)程中的作用機(jī)制是怎樣的，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為220±20g，購(gòu)自南京安立默實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2009－0007號(hào)。同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)分組方法，將60只SD大鼠分為正常對(duì)照組、腦缺血再灌注模型組、電針“百會(huì)、風(fēng)府”組、電針?lè)墙?jīng)穴組、尼莫地平治療組，每組各12只。

1.2 藥品 水合氯醛，批號(hào):W20091022，生產(chǎn)企業(yè):中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;80萬(wàn)單位青霉素，批號(hào):20100627，生產(chǎn)企業(yè):哈藥集團(tuán)制藥總廠;尼莫地平，批號(hào):20100509，生產(chǎn)企業(yè):上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司;多聚甲醛，批號(hào):091020，生產(chǎn)企業(yè):中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.3 主要試劑及儀器 CPG15單克隆抗體(BS－2464R)，生產(chǎn)批號(hào):909881W，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP－9000，生產(chǎn)批號(hào)812257A，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;3－二氨基聯(lián)苯胺(diam inobenzidine，DAB)顯色試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;一抗稀釋液，購(gòu)自碧云生物技術(shù)研究所;抗原修復(fù)液，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;L734型冷光立式四孔手術(shù)無(wú)影燈，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠;PCE－A型程控電針治療儀，安徽天恒有限公司制;932型電熱燒灼器，上海醫(yī)療器械八廠;TB－718自動(dòng)包埋機(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;LEICA RM2135自動(dòng)切片機(jī)，LEICA公司;TK2218I恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;OLYMPUS VANOX顯微鏡，日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社;LEICA ASP200自動(dòng)脫水機(jī)，LEICA公司;南京捷達(dá)JD2801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)，南京捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件 動(dòng)物于安靜的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫控制在(24±1)℃的范圍、相對(duì)濕度(55±5)%的環(huán)境中，12h明暗交替，塑料籠內(nèi)以無(wú)菌木屑做墊料，食水自取。

2 方法

2.1 模型制作方法 參照Z(yǔ)ea Longa方法［3］，使用一端涂抹硅樹(shù)脂尼龍絲，將尼龍絲插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，閉塞大腦中動(dòng)脈(MCA)，阻斷MCA的血流2小時(shí)，后將尼龍絲輕輕拔出，從而復(fù)制腦缺血再灌注(BI/R)大鼠模型，模型復(fù)制成功的標(biāo)志為大鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合征(左側(cè)瞳孔縮小)，麻醉清醒時(shí)出現(xiàn)左前肢或左前后肢癱瘓，線栓拔出后頸內(nèi)動(dòng)脈、Willis環(huán)無(wú)血栓及出血為標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后傷口部碘伏消毒，術(shù)后3天連續(xù)腹腔注射青霉素鈉(8萬(wàn)U/d)預(yù)防感染。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用Longa 5分法標(biāo)準(zhǔn)［3］，在大鼠腦缺血2h再灌注動(dòng)物蘇醒時(shí)和治療2周后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分:0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分，向外側(cè)劃圈;3分，向?qū)?cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

2.3 治療方法 電針經(jīng)穴組選擇“百會(huì)”、“風(fēng)府”穴，具體定位:“百會(huì)”穴位于大鼠頂骨與頂間骨之間凹陷處;“風(fēng)府”穴位于枕骨下方正中凹陷處。針刺方法:穴位處常規(guī)消毒后，以30號(hào)1寸毫針斜刺入“百會(huì)”穴、“風(fēng)府”穴約0.5寸，將針柄分別連接至電針儀上，“百會(huì)”穴接陰極，“風(fēng)府”穴接陽(yáng)極，電針頻率2Hz，疏波，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度，一般3～5mA，時(shí)間30min，每天1次，均在上午10點(diǎn)左右進(jìn)行，連續(xù)治療2周。電針?lè)墙?jīng)穴組統(tǒng)一選擇右臀部非經(jīng)非穴位置針刺，接電針刺激，刺激參數(shù)同電針經(jīng)穴組。西藥治療組以尼莫地平混懸液，按20mg/kg·d量灌胃，每日2次(上午8點(diǎn)，下午4點(diǎn))，連續(xù)灌胃治療2周。

2.4 標(biāo)本取材 于造模后2周各個(gè)相應(yīng)的時(shí)間位點(diǎn)以10%水合氯醛麻醉(3.6mL/kg)大鼠，打開(kāi)胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化生理鹽水250mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250mL，灌流固定30min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1d，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

2.5 指標(biāo)檢測(cè) SP染色:Ⅰ抗CPG15稀釋濃度為1∶100，陰性對(duì)照組采用正常山羊血清替代Ⅰ抗進(jìn)行，DAB2H2O2顯色液顯色，蘇木精輕度復(fù)染。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，相近部位同倍10×40，7個(gè)不同視野，采用南京捷達(dá)JD－801圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)海馬區(qū)CPG15陽(yáng)性細(xì)胞總面積單位和平均光密度值。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)比 見(jiàn)表1。由表1可以看出模型組大鼠神經(jīng)功能缺損顯著差于正常對(duì)照組，P＜0.01。電針經(jīng)穴組與西藥治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差異不顯著，P＞0.05;而較模型組兩者均有顯著性差異，P＜0.01;較正常對(duì)照組有一定差異性，P＜0.05。電針?lè)墙?jīng)穴組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組比較差異不明顯，P＞0.05，且顯著弱于電針經(jīng)穴組和西藥對(duì)照組，P＜0.01。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分治療前后對(duì)比(分)

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分治療前后對(duì)比(分)

注:與正常對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;與腦缺血再灌注模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與電針“百會(huì)、風(fēng)府”組比較，##P＜0.01，#P＜0.05;與電針?lè)墙?jīng)穴組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05;與尼莫地平治療組比較，◆◆P＜0.01，◆P ＜0.05。

周后正常對(duì)照組 12 0 0＊＊#★★◆組別 數(shù)量(只) 治療前 2模型組 12 2.796 ±0.186 2.524 ±0.482▲▲##◆◆電針經(jīng)穴組 12 2.652 ±0.224 0.794 ±0.156▲＊＊★★電針?lè)墙?jīng)穴組 12 2.787 ±0.253 1.986 ±0.269▲▲##◆◆西藥治療組 12 2.543 ±0.149 0.788 ±0.346▲＊＊★★

3.2 光鏡下觀察結(jié)果 光鏡下，正常組只見(jiàn)極少量棕褐色的CPG15陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，而B(niǎo)I/R模型組、電針經(jīng)穴組、電針?lè)墙?jīng)穴組、藥物治療組腦中均可見(jiàn)不同程度的棕褐色的CPG15陽(yáng)性細(xì)胞，以海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞密度增加為顯著。呈卵圓形或圓形，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色較深，多為星形膠質(zhì)細(xì)胞。以正常羊血清代替CPG15一抗孵育對(duì)照組的切片，結(jié)果為陰性，見(jiàn)圖1。從各組照片可以看出正常組大鼠海馬區(qū)CPG15陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色極淺，量少，而其余四組大鼠海馬區(qū)CPG15陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色明顯變深，量多，其中以電針經(jīng)穴組與西藥治療組CPG15陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色最為顯著，而電針?lè)墙?jīng)穴組大鼠海馬區(qū)CPG15陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色相對(duì)較淺，與模型組差異不明顯。

圖1 免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠缺血再灌注海馬區(qū)CPG15蛋白表達(dá)情況

3.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)海馬組織CPG15 見(jiàn)表2。由表2可以看出正常組CPG15陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)不顯著，平均光密度值低，較其他各組均有顯著性差異，P＜0.01;其他各組CPG15陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值均有提高，且電針經(jīng)穴組與尼莫地平組表達(dá)最明顯，此兩組之間比較差異性不顯著，P＞0.05，但較模型組和電針?lè)墙?jīng)穴組有顯著性差異，P＜0.01，而模型組與電針?lè)墙?jīng)穴組CPG15陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值比較，差異性不大，P＞0.05。說(shuō)明電針和西藥尼莫地平對(duì)于增強(qiáng)CPG15的表達(dá)起到明顯促進(jìn)作用。

表2 各組缺血2h再灌注CPG15表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞單位面積和平均光密度值治療后對(duì)比

4 討論

CPG15是以色列科學(xué)家Nedivi等于1993年通過(guò)構(gòu)建谷氨酸類(lèi)似物海人藻酸(KA，kainic acid)激活型大鼠海馬齒狀回 cDNA文庫(kù)得到的一個(gè)基因［4］。1996年，Nedivi［5］從KA激活型大鼠海馬齒狀回cDNA文庫(kù)和人類(lèi)皮質(zhì)cDNA文庫(kù)篩選、鑒定得到CPG15，并進(jìn)行了初步的功能研究發(fā)現(xiàn)CPG15能促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng)，故又將其命名為Neuritin。CPG15是一個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因［6］，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中主要在海馬、嗅球中表達(dá);而在成年后，表達(dá)限制在那些發(fā)生結(jié)構(gòu)改變并與神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)的組織［7］。CPG15蛋白能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成;其表達(dá)主要局限于神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)可塑性相關(guān)的區(qū)域，且神經(jīng)活動(dòng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophines，NTs)均能誘導(dǎo)其表達(dá)，提示CPG15可能與神經(jīng)活動(dòng)及NTs促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用有關(guān)［8］。這些特點(diǎn)使CPG15成為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟及創(chuàng)傷修復(fù)中重要候選因子。CPG15在促進(jìn)突觸成熟、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元等方面有重要作用［9］。并且介導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)促進(jìn)成人感覺(jué)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)［10］。

神經(jīng)細(xì)胞之間通過(guò)特異的通訊結(jié)構(gòu)——“突觸”形成功能性神經(jīng)環(huán)路來(lái)傳遞和存儲(chǔ)信息。突觸在神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)活動(dòng)影響下可發(fā)生特異性的結(jié)構(gòu)和功能變化，這稱之為“突觸可塑性”。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶中起著至關(guān)重要的作用。電針治療腦梗塞的生物學(xué)基礎(chǔ)是通過(guò)多種機(jī)制影響神經(jīng)元可塑性，目前關(guān)于針灸對(duì)腦神經(jīng)可塑性研究已見(jiàn)部分報(bào)道，盧圣鋒等［11］以SAMP8小鼠作為老年癡呆(AD)動(dòng)物模型，電針“百會(huì)”、“涌泉”穴，發(fā)現(xiàn)電針能有效調(diào)整海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進(jìn)突觸形態(tài)可塑性的發(fā)揮。徐虹等［12］觀察到，電針能夠抑制損傷相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，認(rèn)為針刺可能通過(guò)上調(diào)損傷－修復(fù)網(wǎng)絡(luò)功能，促進(jìn)梗死區(qū)神經(jīng)功能的恢復(fù)。高劍鋒等［13］研究發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血再灌注可激活老齡大鼠海馬角回(dentate gyrus，DG)區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，針刺穴位能使局灶腦缺血再灌注后海馬DG區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，有效提高神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化，合理調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，從而發(fā)揮拮抗腦缺血再灌注損傷作用。趙丹等［14］研究多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經(jīng)可塑性中的作用及電針的影響，發(fā)現(xiàn)電針可以對(duì)腦缺血后多巴胺D1、D2受體的數(shù)量和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，減輕其損害作用，促進(jìn)其達(dá)到平衡狀態(tài)，從而對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示針刺對(duì)促進(jìn)大鼠缺血再灌注損傷區(qū)CPG15陽(yáng)性細(xì)胞含量的表達(dá)起到顯著促進(jìn)作用，同時(shí)神經(jīng)功能得到明顯改善，說(shuō)明針刺對(duì)腦神經(jīng)可塑性具有促進(jìn)意義。據(jù)此我們認(rèn)為針灸治療腦梗塞，促進(jìn)腦神經(jīng)可塑性的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)CPG15而發(fā)揮作用。CPG15基因參與了腦缺血損傷后神經(jīng)再生的調(diào)控。

百會(huì)、風(fēng)府均為督脈經(jīng)穴，督脈又歸屬于腦。此外，根據(jù)《靈樞·衛(wèi)氣》中“氣街”理論，“頭氣有街”、“氣在頭者，止之于腦”，即經(jīng)氣到頭部的都聯(lián)系于腦。又根據(jù)“四?！崩碚?，“腦為髓?！?，楊上善注說(shuō)“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也，是腎所生，其氣上輸腦蓋百會(huì)穴，下輸風(fēng)府也”?？梢?jiàn)，百會(huì)穴、風(fēng)府穴與腦密切聯(lián)系，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。針刺百會(huì)、風(fēng)府穴，具有醒腦開(kāi)竅、健腦補(bǔ)髓、疏風(fēng)通絡(luò)的功效，因此選取此二穴作為電針治療腦缺血再灌注損傷模型的處理穴位。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了針刺“百會(huì)”、“風(fēng)府”可以促進(jìn)大鼠受損神經(jīng)功能恢復(fù)，能提高大鼠海馬區(qū)CPG15表達(dá)，說(shuō)明電針對(duì)腦缺血再灌注后腦細(xì)胞的神經(jīng)可塑性有促進(jìn)作用。這為臨床針灸治療腦梗塞提供了理論依據(jù)。

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