發(fā)酵液中替考拉寧含量的HPLC法測(cè)定

張波

替考拉寧(Teicoplanin)為新型糖肽類抗生素，抗菌譜及抗菌活性與萬古霉素相似，對(duì)金黃色葡萄球菌的作用比萬古霉素更強(qiáng)，不良反應(yīng)更少。本品對(duì)革蘭陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌和大多厭氧性革蘭陽性菌敏感，具有較強(qiáng)的殺菌活性。由于替考拉寧獨(dú)特的作用機(jī)制，很少出現(xiàn)耐替考拉寧的菌株，所以對(duì)青霉素類及頭孢菌素類，大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氯霉素類，氨基糖苷類和利福平耐藥的革蘭陽性菌，仍對(duì)替考拉寧敏感［1，2］。本文采用高效液相色譜法，乙腈-磷酸鹽體系作為流動(dòng)相，對(duì)發(fā)酵液中的替考拉寧含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，結(jié)果滿意。

1 儀器與試劑

Waters1525型液相色譜儀(美國Waters公司)，UV100型紫外檢測(cè)器，替考拉寧對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，替考拉寧樣品(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);乙腈(色譜純，天津四友公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)-乙腈(75∶25)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長為 254 nm，進(jìn)樣量 10 μl。

2.2 檢測(cè)波長的選擇 對(duì)替考拉寧對(duì)照品的流動(dòng)相溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在254 nm附近有較大吸收，在此波長處發(fā)酵液無明顯干擾，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取替考拉寧對(duì)照品約20 mg，置10 ml容量瓶中，振搖，用流動(dòng)相溶解至刻度，作為供試品溶液，另取替考拉寧樣品適量，同法操作。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取10 μl對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在該色譜條件下，替考拉寧峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.2。

2.5 破壞性試驗(yàn) 稱取替考拉寧對(duì)照品各約200 mg，分別置于3個(gè)100 ml容量瓶中，分別加入1 mol/L鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉，3%的過氧化氫溶液各10 ml，于室溫放置1 h，用流動(dòng)相定容，作為破壞后的供試品溶液，分別取10 μl注入液相色譜儀，結(jié)果替考拉寧與雜質(zhì)分離良好。

2.6 線性關(guān)系 精密稱取替考拉寧對(duì)照品適量，分別制成每1 ml中含替考拉寧 500.0，1000.0，2000.0，3000.0，4000.0，5000.0 μg的溶液，注入液相色譜儀，以替考拉寧峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為:

A=487939 C，r=0.9988

2.7 最低檢測(cè)限 采用逐級(jí)稀釋法，以S/N≥3為最低檢出限，測(cè)得最低檢測(cè)限為4.50ng。

2.8 精密度試驗(yàn) 試驗(yàn)按2.3項(xiàng)下配制的2000 μg/ml的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其RSD為0.55%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的替考拉寧樣品，制成2.3項(xiàng)下濃度的替考拉寧供試品溶液，共6份，分別精密加入含已知量的對(duì)照品溶液，搖勻，取10 μl進(jìn)樣，結(jié)果替考拉寧的平均回收率為100.2%(RSD=0.14%，n=6)。結(jié)果見表1

2.10 發(fā)酵液中樣品測(cè)定 取約20 ml發(fā)酵液用2 mol/L氫氧化鈉調(diào) pH=11，攪拌10 min，在3000轉(zhuǎn)/min下離心10 min，取上清液，以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至8.5，取調(diào)后上清液，過濾。取稀釋配制成約2000 μg/ml的溶液，搖勻，過濾，取10 μl進(jìn)樣，結(jié)果在此色譜條件下，發(fā)酵液中雜質(zhì)對(duì)主峰無干擾，分析重復(fù)性及精密度結(jié)果較滿意。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本文采用乙腈-磷酸鹽體系作為流動(dòng)相對(duì)替考拉寧進(jìn)行樣品測(cè)定，精密度好，色譜峰對(duì)稱性也較好，同時(shí)我們還對(duì)樣品溶液經(jīng)過不同時(shí)間的放置來檢驗(yàn)樣品在溶液中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)樣品在本流動(dòng)相溶液中相當(dāng)穩(wěn)定，適宜于成品的檢測(cè)和發(fā)酵液中間體的質(zhì)量控制。

［1］夏振強(qiáng)，古勇，官家發(fā).糖肽類抗生素替考拉寧研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，18(2):236-238.

［2］何禮賢，潘玨，陳世耀，等.替考拉寧治療革蘭陽性球菌感染的臨床研究.中華內(nèi)科雜志，2005，33(5):532-533.