6種固定液短時(shí)間固定對(duì)冰凍切片制片效果影響

徐云生 倪開志

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。由于其制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。但在冰凍切片制作過(guò)程中，影響制片的質(zhì)量因素較多，從而影響手術(shù)中的快速病理診斷。因此，快速制作一張高質(zhì)量的冰凍切片對(duì)于確保病理診斷極其重要。其中固定是冰凍切片制作中關(guān)鍵步驟之一，對(duì)切片的制片質(zhì)量有著重要的影響。本文通過(guò)6種不同固定液短時(shí)固定對(duì)冰凍切片制片染色的比較，探討不同固定液對(duì)冰凍切片制片效果的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 選自楚雄州人民醫(yī)院病理科手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本40例，包括有乳腺、甲狀腺、胃、子宮、卵巢等組織。

1.2 固定液 6種固定液分別為：10%福爾馬林;95%酒精;AF固定液;丙酮∶甲醇∶乙醚酒精(乙醚∶酒精1∶1)。

1.3 方法

1.3.1 取材及切片 取材大小為1.5 cm×1.5 cm，厚2～3 mm的新鮮組織，用OCT包埋劑包埋后，放進(jìn)徠卡恒溫冷凍切片機(jī)(溫度-18℃ ～20℃)，1～2 min后，每例標(biāo)本連續(xù)切片各6張，厚度4～5 μm。

1.3.2 固定及染色 切片后立即放進(jìn)上述6種不同的固定液(室溫20～25℃)固定6 s。將固定過(guò)的切片用蒸餾水洗30 s，放進(jìn)改良的GILL蘇木素液(預(yù)先放在65°恒溫水域箱加熱)2 min，自來(lái)水洗，1%鹽酸酒精分化液分化10 s，溫水(50℃)藍(lán)化30 s，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

切片制作好后，通過(guò)對(duì)6種不同固定液的對(duì)比，在顯微鏡下觀察切片的組織清晰度、細(xì)胞收縮度、細(xì)胞核染色、細(xì)胞漿染色、核漿對(duì)比情況。結(jié)果見表1。

表1 6種不同固定液的對(duì)比

從觀察結(jié)果顯示，在6中固定液固定的冰凍切片中，經(jīng)乙醚酒精固定后的冰凍切片，鏡下組織細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞無(wú)收縮，細(xì)胞核、細(xì)胞漿染色鮮艷，核漿對(duì)比良好。甲醇固定的冰凍切片質(zhì)量次之。95%酒精固定的切片，除細(xì)胞明顯收縮外，組織結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞染色尚可。丙酮和AF液固定的冰凍切片，組織結(jié)構(gòu)較清晰度稍差，細(xì)胞漿染色及核漿對(duì)比均差，而且丙酮固定的細(xì)胞收縮較為嚴(yán)重。10%福爾馬林固定的冰凍切片組織清晰度、細(xì)胞核染色、細(xì)胞漿染色及核漿比均差，同時(shí)細(xì)胞腫脹，尤其是細(xì)胞核明顯腫脹、模糊。

3 討論

冰凍切片的目的是在短時(shí)間內(nèi)作出準(zhǔn)確的病理診斷，協(xié)助臨床醫(yī)生確定病變的范圍，決定手術(shù)的范圍，因此，必須盡一切可能爭(zhēng)取時(shí)間，爭(zhēng)取盡快早出切片，并保證質(zhì)量，所以快速制作一張高質(zhì)量的冰凍切片非常重要。中華醫(yī)學(xué)會(huì)規(guī)定完成冰凍HE染色切片制備時(shí)間通常為20～25 min［1］，在冰凍切片制片中，固定液的選擇及固定的時(shí)間長(zhǎng)短是冰凍切片HE染色的一個(gè)關(guān)鍵步驟。用于冰凍組織的固定液種類較多，大多數(shù)固定液需要固定幾分鐘至十幾分鐘時(shí)間，如果只固定數(shù)秒鐘，則大多數(shù)切片固達(dá)不到診斷的要求。由于冰凍切片是由快速切片，快速固定，快速染色這三個(gè)方面相互影響所造成的，其中由于組織固定液因素影響組織細(xì)胞形態(tài)的改變，對(duì)病理醫(yī)生的診斷影響最大，遠(yuǎn)比其他技術(shù)員操作因素引起的組織細(xì)胞形態(tài)改變更難把握。研究表明10%福爾馬林雖然對(duì)組織的穿透力強(qiáng)，固定效果好，但需要固定的時(shí)間長(zhǎng)，而且它不能抵消因冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的腫脹，所以甲醛固定的組織，核發(fā)生腫脹、模糊［2］。從上述6種固定液的比較來(lái)看，如果只進(jìn)行數(shù)秒鐘的短時(shí)固定，10%的福爾馬林和AF液固定的組織，組織清晰度差，細(xì)胞核和細(xì)胞漿著色較淡，核漿對(duì)比差。95%酒精固定效果尚可，但細(xì)胞收縮明顯，核漿著色稍差。丙酮固定劑，對(duì)組織穿透性強(qiáng)，但細(xì)胞嚴(yán)重收縮，核漿對(duì)比差。甲醇固定的組織，細(xì)胞輕度收縮性，組織結(jié)構(gòu)清晰，核著色好。但是乙醚酒精固定液的冰凍切片能較好的保存細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，組織清晰，背景干凈，細(xì)胞無(wú)收縮，核漿染色鮮艷，核漿對(duì)比良好，是6種固定液中最好的。因此，乙醚酒精可以短時(shí)間內(nèi)固定細(xì)胞，縮短制片時(shí)間，是一種較為理想的冰凍切片快速固定液。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范，病理學(xué)分冊(cè)．北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：10-11．

［2］孫和國(guó)，何毅敏．三種固定液對(duì)冰凍組織切片固定效果的比較．診斷病理學(xué)雜志，2001，8(2)：114．