RP-HPLC法測(cè)定人血清中多索茶堿的濃度

王淑梅，張志清，楊秀嶺，王楠，張君（.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊市050000；.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊市 05007）

多索茶堿（Doxofylline）為新型的非腺苷阻滯性支氣管擴(kuò)張藥，具有平喘、抗炎和鎮(zhèn)咳作用。其療效較茶堿強(qiáng)，耐受性好，且不良反應(yīng)較茶堿少，在治療支氣管痙攣方面可能成為茶堿替代品[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，多索茶堿對(duì)血管有獨(dú)特的耐受性，對(duì)中樞神經(jīng)和胃腸道等無(wú)影響；對(duì)患有嚴(yán)重肝功能損害或伴隨喹諾酮類藥物治療的患者應(yīng)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定多索茶堿血藥濃度已有文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]，樣品處理方法主要有沉淀蛋白法和提取法。本試驗(yàn)采用RPHPLC法對(duì)人血清中多索茶堿的濃度進(jìn)行測(cè)定，并探索和改進(jìn)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括515泵、486檢測(cè)器、Rheodyne 7725i進(jìn)樣閥、Empower Pro工作站（美國(guó)Waters公司）；GL-20G-Ⅱ離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GL-88B渦旋混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

多索茶堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100625-200301）；內(nèi)標(biāo)：咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：171215-200608）；甲醇為色譜純，異丙醇和三氯甲烷為分析純?？瞻籽逵山】凳茉囌咛峁?。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（30∶70）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 多索茶堿對(duì)照品貯備液：準(zhǔn)確稱取多索茶堿對(duì)照品50.80 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，得質(zhì)量濃度為1 016 μg·mL－1的多索茶堿對(duì)照品貯備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌?1.20 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，精密吸取1.5 mL該溶液置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，得質(zhì)量濃度為30.72 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品的處理

取血清樣品0.4 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，再加入異丙醇-三氯甲烷（1∶4）5 mL，渦旋混合1 min，4 000 r·min－1離心10 min，取下清液4 mL置于離心管中，50℃恒溫水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)恿鲃?dòng)相100 μL溶解，取20 μL進(jìn)樣。

2.4 方法專屬性

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，多索茶堿與內(nèi)標(biāo)峰形良好，分離完全，其保留時(shí)間分別為9.5、6.4 min。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.空白血清+多索茶堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；1.多索茶堿；2.咖啡因Fig1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.blank serum+reference substance+internal substance；1.doxofyline；2.caffeine

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取空白血清0.4 mL，加入多索茶堿系列對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，搖勻，使多索茶堿濃度分別為0.101 6、0.254、0.508、1.016、2.302、4.064、8.128 μg·mL－1，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜。以多索茶堿濃度（X）為橫坐標(biāo)，多索茶堿與咖啡因峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0.986 8X+0.022 8（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，多索茶堿血藥濃度在0.1016～8.128 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低檢測(cè)濃度為0.011 μg·mL－1。

2.6 回收率試驗(yàn)

2.6.1 提取回收率：分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清對(duì)照品溶液各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定，以所得的色譜峰面積與相應(yīng)濃度多索茶堿對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積進(jìn)行比較，考察樣品提取回收率。3種濃度下多索茶堿提取回收率分別為93.59%、95.52%和92.32%，RSD分別為5.55%、2.22%和3.75%。

2.6.2 方法回收率：分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定，測(cè)得多索茶堿濃度，以實(shí)測(cè)濃度與加入濃度之比計(jì)算方法回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7 精密度試驗(yàn)

分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，于同日內(nèi)和5 d分別進(jìn)樣分析，測(cè)定日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

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表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

加入濃度/μg·mL-1 RSD/%4.65 8.60 3.74測(cè)得濃度/μg·mL-1方法回收率/%RSD/%0.254 1.016 4.064 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 84.57 93.82 92.93 4.65 7.34 2.91日內(nèi)精密度測(cè)得濃度/μg·mL-1 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 RSD/%4.65 7.34 2.91日間精密度測(cè)得濃度/μg·mL-1 0.214 7±0.01 0.929 6±0.08 4.011±0.15

2.8 樣品穩(wěn)定性考察

配制中濃度（1.016 μg·mL－1）的血清樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別在0、2、4、8 h時(shí)測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算多索茶堿含量。結(jié)果表明，處理后的血清樣品室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD＝1.13%（n＝3）。另配制中濃度的血清樣品，反復(fù)凍融（－20℃）3次后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果表明，樣品反復(fù)凍融3次后性質(zhì)穩(wěn)定，RSD＝1.60%（n＝3）。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)查閱文獻(xiàn)，優(yōu)選出的色譜條件以甲醇-水（30∶70）為流動(dòng)相，配比簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。內(nèi)標(biāo)咖啡因在該色譜條件下，與多索茶堿完全分離，峰形和保留時(shí)間均較理想。樣品處理采用異丙醇-三氯甲烷（1∶4）進(jìn)行提取，提取液簡(jiǎn)便易得，可避免因沉淀蛋白不完全而造成的色譜柱堵塞。

試驗(yàn)表明，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好，可用于多索茶堿的血藥濃度測(cè)定及其臨床藥動(dòng)學(xué)研究。

[1]顧 健，張春燕，曹兆龍，等.多索茶堿片在中國(guó)人的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)新藥雜志，2000，9（6）：396.

[2]徐彥貴，卜一珊，何振梅，等.RP-HPLC法測(cè)定人血漿中多索茶堿濃度[J].中國(guó)藥師，2002，5（8）：467.

[3]張 波，劉 艷，杜智敏，等.反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中多索茶堿的濃度[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（1）：88.

[4]闞全程，李朵璐，師秀琴.HPLC測(cè)定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：845.