LC-MS/MS法同時測定人血漿中對稱性二甲基精氨酸和非對稱性二甲基精氨酸的濃度

朱金輝，萬麗麗，郭澄（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海市200233）

對稱性二甲基精氨酸（Symmetric dimethylarginine，SDMA）和非對稱性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一對同分異構體，主要來自于體內甲基化蛋白的水解，兩者在體內發(fā)揮不同的生理調節(jié)作用。ADMA是一種內源性的一氧化氮合酶（NOS）抑制劑，可與精氨酸競爭性結合NOS活性部位，對調節(jié)一氧化氮合成和內皮功能起著非常重要的作用[1]。大量的臨床研究證實，伴有內皮功能不全的心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭和糖尿病等患者的血中ADMA水平均有顯著增加，且ADMA水平的升高與心血管事件的發(fā)生率和病死率呈明顯正相關[2]。而SDMA雖然對NOS沒有作用，但是能夠反映腎功能的變化，是腎小球濾過率變化的一個早期標志物[3]。因此，無論從試驗角度還是臨床需求，都需要建立一種快速、簡便、準確測定血液中ADMA和SDMA的方法。由于ADMA和SDMA的化學性質十分接近，以往的文獻報道，在樣品處理時大多采用加入衍生化試劑對兩者進行色譜分離以后再測定，步驟煩瑣、費時[4]。近幾年，隨著質譜技術的發(fā)展，有研究表明[5]，可利用ADMA和SAMA各自的特征碎片離子峰同時檢測其濃度，免去了色譜分離的步驟，簡化了樣品處理過程，適用于臨床大規(guī)模樣本的檢測。本研究在此基礎上對方法作了進一步的優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent QQQ液相色譜/質譜聯(lián)用儀，包括G1311A型四元輸液泵、G1322A型脫氣機、G1367B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G6410B型三重串聯(lián)四極桿質譜、電噴霧源和Mass-Hunter工作站（美國Agilent公司）；Millipore Simplicity 185型超純水系統(tǒng)（法國Millipore公司）；Vortex Genie 2型渦旋混懸器（美國Vortex公司）；TG16-WS臺式高速離心機（中國湘儀公司）。

1.2 試藥

SDMA對照品（批號：D00085051，純度：＞98.0%）、ADMA對照品（批號：D00069835，純度：＞98.0%）均采購自美國Sigma公司；內標：氫溴酸右美沙芬對照品（批號：100201-200502，純度：94.9%）購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲酸、甲酸銨為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：Thermo Hypercarb柱（50 mm×4.6 mm，5 μm）；Zorbax SB-C8保護柱（2.1 mm×12.5 mm）；流動相：乙腈∶甲酸銨-甲酸緩沖溶液（5 mmol·L－1甲酸銨，0.1%甲酸）（梯度洗脫程序見表1）；流速：0.40 mL·min－1；分析時間：8 min；進樣量：5 μL；柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution process of mobile phase

電噴霧電離源（ESI源），霧化氣（N2）壓力：35 psi；干燥氣（N2）流速：10 mL·min－1；干燥氣溫度：350 ℃；正離子方式檢測；毛細管電壓：3 500 V；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）。MRM檢測參數(shù)見表2。ADMA、SDMA的二級質譜見圖1。

表2 MRM檢測參數(shù)Tab2 MRM parameters for the detection

圖1 二級質譜圖A.ADMA；B.SDMAFig1 MS2 spectrumA.ADMA；B.SDMA

2.2 溶液的配制

2.2.1 SDMA貯備液：準確稱取SDMA對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg·mL－1的SDMA標準貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 ADMA貯備液：準確稱取ADMA對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg·mL－1的ADMA標準貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 工作溶液：取SDMA和ADMA貯備液適量，以水稀釋，制備成相當于濃度為0.5、1、2、2.5、5、10 mg·mL－1的系列混標溶液。

2.2.4 內標溶液：準確稱取氫溴酸右美沙芬對照品適量，以乙腈溶解，配制成濃度為50 ng·mL－1的內標溶液。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取待測血漿100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含內標右美沙芬50 ng·mL－1的乙腈溶液，渦旋30 s，13 000 r·min－1離心6 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.4 標準曲線的制備

取空白血漿100 μL，加混標溶液5 μL，制成相當于SDMA和ADMA濃度均為25、50、100、125、250、500 ng·mL－1的模擬血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，建立標準曲線。以待測物的濃度（X）為橫坐標，對照品與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，同時將5份空白血漿中的峰面積比值取均值，作為背景扣除后，進行線性回歸運算，求得線性回歸方程分別是：YSDMA＝0.005 2XSDMA+0.038 8（r＝0.999 8）、YADMA＝0.005 8XADMA+0.063 5（r＝0.995 3）。結果表明，SDMA和ADMA血藥濃度均在25～500 ng·mL－1范圍內線性關系良好，方法的定量下限均為25 ng·mL－1，RSD分別為6.36%和5.70%。

2.5 準確度及精密度試驗

取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的混標溶液5 μL，按“2.3”項下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質控樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，并隨行標準曲線，以當日的標準曲線計算標準樣品的濃度，分別求算方法回收率和日內、日間精密度，結果見表3。

表3 回收率及精密度試驗結果（n＝6）Tab 3Results of recovery and precision tests（n＝6）

2.6 基質效應考察

取空白血漿100 μL，除使用不含內標的乙腈沉淀蛋白外，其他按“2.3”項下方法操作后，用獲得的上清液中加入低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質控樣品和內標溶液，進樣獲得峰面積；同樣以水代替空白血漿進行相同處理，獲得峰面積。比較2種處理方式下，用3種化合物的峰面積之比評價基質效應。SDMA和ADMA比值在105%～120%，內標的比值在90%～95%。結果表明，本方法不受基質效應的影響。

2.7 穩(wěn)定性考察

取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的混標溶液5 μL，按“2.2.3”項下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質控樣品，按“2.3”項下方法進行處理和測定，分別考察SDMA和ADMA血漿樣品（未處理）室溫放置4 h，4℃放置24、48 h，處理后室溫放置24 h，3周期凍融試驗和－20℃冷凍放置1、2、4周的穩(wěn)定性。結果，未處理的樣品在以上保存條件下測得的相對誤差（RE）均在±10%之內，RSD均＜15%；處理后24 h內RE在±4.62%之內，RSD＜4.8%，表明血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

3 討論

在對SDMA和ADMA進行質譜分析時發(fā)現(xiàn)，二者在色譜柱上的保留行為十分相似，出峰時間一致。二者且擁有幾乎相同的碎片離子峰，但其中有2個碎片離子峰卻是各自所特有的：m/z203.1→172.1（SDMA）與m/z203.1→46.1（ADMA）。對20 ng·mL－1對照品進樣的結果顯示，信噪比分別是69和58，可用于定量分析。ADMA和SDMA的碎片離子峰見表4。

本方法所用的色譜柱為Thermo公司的Hypercarb柱，填料為石墨炭（Graphitic carbon），對比Agilent的C18柱和苯基柱，Hypercarb柱對SDMA和ADMA的響應更好，以20 ng·mL－1對照品為例，其響應值是苯基柱的10倍。保留時間C18柱在0.5min就出峰，易受血漿中其他物質的干擾；Hypercarb柱的保留時間在1.9 min，特異性較高，受基質效應影響小。

表4 ADMA和SDMA的碎片離子峰Tab4 Fragment ion peak ofADMAand SDMA

對于內標的選擇，國外文獻通常采用同位素內標，能夠直觀地解決穩(wěn)定性、特異性等問題，但價格比較昂貴，用于常規(guī)檢測顯然成本過高。而SDMA、ADMA的同系物幾乎都是內源性的物質，也不可采用。因此，筆者在內標的選擇上花費了一定時間，最后選擇的右美沙芬符合內標的要求，對SDMA和ADMA的檢測無干擾。

ADMA作為一個NOS的內源性抑制劑，在近幾年得到了越來越多的關注，相當數(shù)量的臨床研究證實了ADMA在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中所扮演的重要角色[6]。對于ADMA如何應用于疾病的預防及藥物對其的干預作用，目前尚處在研究中，但是一個快速、準確的血漿濃度測定方法無論對于臨床研究還是科研探索都是必要的手段。

[1]Boger RH.Asymmetric dimethy larginine（ADMA）：Anovel risk marker in cardiovascular medicine and beyond[J].Ann Med，2006，38（2）：126.

[2]Anderssohn M，Schwedhelm E，B?ger RH，et al.Asymmetric dimethylarginine as a mediator of vascular dysfunction and a marker of cardiovascular disease and mortality：an intriguing interaction with diabetes mellitus[J].Diab Vasc Dis Res，2010，7（2）：105.

[3]Jan T，Hendrik V，Jens Martens，et al.SDMA is an early marker of change in GFR after living-related kidney donation[J].Nephrol Dial Transplant，2011，26（1）：324.

[4]Horowitz JD，Heresztyn T.An overview of plasma concentrations of asymmetric dimethylarginine（ADMA）in health and disease and in clinical studies：Methodological considerations[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，851（1）：42.

[5]Gary W，Bernard F，Michael P，et al.Arginine and methylated arginines in human plasma and urine measured by tandem mass spectrometry without the need for chromatography or sample derivatisation[J].Journal of Chromatography B，2008，874（1）：27.

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