2種硫酸氫氯吡格雷片在健康人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究

吳寅，栗艷，丁黎，王婧雯，賈艷艷，劉渝，楊林，文愛(ài)東#（.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安市 7003；.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京市 0009）

氯吡格雷（Clopidogrel）是繼噻氯匹定后第2個(gè)噻吩并吡啶藥物，其可選擇性地、不可逆地與血小板膜表面一種嘌呤性二磷酸腺苷（ADP）受體結(jié)合，是一種高選擇性ADP受體阻滯藥。氯吡格雷阻滯ADP對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用，從而促進(jìn)腺苷-3'，5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）依賴的、前列腺素E1（PGE1）刺激的舒血管物質(zhì)刺激磷酸蛋白（VASP）的磷酸化[1]，抑制纖維蛋白原受體（GPⅡb/Ⅲa）活化進(jìn)而抑制血小板聚集。此外，氯吡格雷可降低血小板選擇蛋白（P-selectin，CD62）的表達(dá)，表明其可抑制血小板的活化。臨床上廣泛應(yīng)用于心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的治療，但劑量需要個(gè)體化。本試驗(yàn)研究國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口氯吡格雷片在健康人體內(nèi)的藥動(dòng)力，并評(píng)價(jià)2種片劑的生物等效性，旨在為新藥報(bào)批與臨床合理用藥、實(shí)施個(gè)體化用藥方案提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，含雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器及Agilent Chemstation（A.10.02）（美國(guó)Agilent公司）；BT255電子天平（瑞士Sartorius公司）；Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore公司）；TG16-WS型離心機(jī)（上海盧湘儀儀器廠）；XW-80A渦旋振蕩混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

受試制劑：硫酸氫氯吡格雷片（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每片25 mg，批號(hào)：090501S）；參比制劑：硫酸氫氯吡格雷片（商品名：波立維，杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司，規(guī)格：每片75 mg，批號(hào)：2364）；氯吡格雷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.4%，批號(hào)：100819-200601）；內(nèi)標(biāo)：米非司酮對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度：98%，批號(hào)：M8046-100MG）。甲醇為色譜純，乙醚、甲酸為分析純，試驗(yàn)用水為去離子純凈水。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Hanbon Hedera ODS-2（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）；流速：0.25 mL·min－1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

離子檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子極性：正離子（positive）；離子化方式：氣動(dòng)輔助電噴霧離子化（ESI）；檢測(cè)對(duì)象：氯吡格雷m/z322.1→212.1，裂解電壓：105 V，碰撞能量：12 eV；內(nèi)標(biāo)（米非司酮）m/z430.3→372.3，裂解電壓：105 V，碰撞能量：20 eV；干燥氣流速：10 L·min－1；霧化室壓力：40 psi；干燥氣溫度：350℃。全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 全掃描質(zhì)譜圖A.氯吡格雷；B.內(nèi)標(biāo)米非司酮Fig1 Full scan mass spectrumA.clopidogrel；B.mifepristone

2.2 受試者選擇

選擇健康男性志愿者20名，年齡18～40歲，平均（34.5±2.0）歲，體重（62.1±2.6）kg（標(biāo)準(zhǔn)體重（1±10%）），體重指數(shù)（BMI）在19～24 kg·m－2范圍內(nèi)，身高160～180 cm。于試驗(yàn)前進(jìn)行全面的體格檢查，肝腎功能、心電圖、血尿常規(guī)均正常。受試者無(wú)既往病史和藥物過(guò)敏史，精神狀態(tài)良好。受試前4周內(nèi)未服用過(guò)其他藥物。受試者在服藥后禁止劇烈活動(dòng)，采血期間禁煙、酒和含咖啡因類飲料。在臨床醫(yī)師的監(jiān)護(hù)下，觀察受試者的耐受性和不良反應(yīng)的發(fā)生情況以及一般狀況。一旦出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，應(yīng)采取相應(yīng)的急救措施和治療。試驗(yàn)方案經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，受試者均自愿簽署知情同意書。

2.3 給藥方案及血樣采集

20名受試者隨機(jī)分為2組，每組10人。試驗(yàn)前禁食過(guò)夜，次日晨空腹單劑量口服受試制劑或參比制劑各75 mg，用250 mL溫開水送服，服藥后2 h內(nèi)不飲水，4 h后進(jìn)食統(tǒng)一食物（低脂肪飲食）。受試者于服藥前0 h及服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、11、14、24、36 h時(shí)自肘靜脈分別采血約4 mL，置肝素化離心管中，3 000 r·min－1離心15 min取血漿，－20 ℃保存，供血藥濃度測(cè)定使用。經(jīng)過(guò)清洗期1周后，進(jìn)行交叉試驗(yàn)。

2.4 試驗(yàn)溶液的配制

2.4.1 氯吡格雷標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品13.11 mg（含氯吡格雷10.02 mg），置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.002 mg·mL－1的氯吡格雷貯備液。精密量取該貯備液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為100.2 μg·mL－1的氯吡格雷甲醇溶液；再依次稀釋，配成濃度為10.02、1.002、501.2 、100.2、50.12、10.02、5.012 、1.002、0.5012、0.1002 ng·mL－1的系列氯吡格雷甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取非司酮對(duì)照品10.06 mg的，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.006 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密量取該貯備液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為100.6 μg·mL－1米非司酮甲醇溶液；再依次稀釋，配成濃度為10.06、1.006 、100.6 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液。

2.5 血漿樣品處理

于10 mL離心管中，加入血漿樣品1 mL，加入內(nèi)標(biāo)（10.06μg·mL－1米非司酮）溶液 10 μL，渦旋混勻，加入乙醚4 mL，渦旋3 min。于4 000 r·min－1離心10 min，吸取上層有機(jī)相至另一10 mL離心管中，于25℃水浴以氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)?50 μ L流動(dòng)相（甲醇-0.1%甲酸水溶液）（90∶10）溶解，渦旋2 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 600 r·min－1離心5 min，取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，進(jìn)樣5 μL，進(jìn)行液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 專屬性考察：在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)得空白血漿、空白血漿加氯吡格雷對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)及受試者服藥1.5 h后血漿樣品的色譜圖見(jiàn)圖2。在本試驗(yàn)所采用的LC-MS條件下，氯吡格雷酸出峰時(shí)間在2.7 min，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在2.4 min。氯吡格雷酸和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定（見(jiàn)圖2）。本方法測(cè)定血漿中氯吡格雷，具有較高的專屬性。

圖2 典型多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)+氯吡格雷對(duì)照品；C.血漿樣品；1.氯吡格雷；2.米非司酮Fig2 Typical multiple reaction monitoring chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+internal standards+clopidogrel；C.plasma sample；1.clopidogrel；2.mifepristone

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取不同量“2.4.1”項(xiàng)下各濃度氯吡格雷甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，各置于10 mL玻璃離心管中，精密加入空白血漿1 mL，渦旋混勻，配成含氯吡格雷濃度分別為0.005、0.02、0.1、0.3、1.0、3.0、6.0、10.0 ng·mL－1的血漿樣品。按“2.5”項(xiàng)下方法操作，并進(jìn)行色譜分析，記錄氯吡格雷峰面積（As）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）的比值f。以比值f（f＝As/Ai）對(duì)血藥濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：f＝0.332 4×c+0.000 804 6（r＝0.998 7，n＝5），權(quán)重系數(shù)w＝1/c2。結(jié)果表明，氯吡格雷血藥濃度在0.005～10.0 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其中最低定量限（LLOQ）為0.005 ng·mL－1。

2.6.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)：按“2.6.2”項(xiàng)下方法配制氯吡格雷低、中、高3種濃度（0.01、0.6、9.0 ng·mL－1）的血漿樣品各5份。同法操作，進(jìn)行LC-MS分析，測(cè)定血漿中氯吡格雷日內(nèi)、日間精密度及提取、方法回收率。結(jié)果，氯吡格雷提取回收率＞70%，日內(nèi)和日間RSD均＜15%，表明回收率和精密度良好。精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6.4 穩(wěn)定性考察：按“2.6.2”項(xiàng)下方法配制氯吡格雷低、中、高（0.01、0.6、9.0 ng·mL－1）3種濃度的血漿樣品。按“2.5”項(xiàng)下方法同法操作，3份于配制好后立即處理，進(jìn)行LC-MS分析，記錄色譜圖；3份配制好后反復(fù)凍融3次后分析；3份于室溫放置9 h后分析；3份配制好后放入－20℃冰箱中冰凍保存1.5個(gè)月后取出化凍分析；3份配制好后放入－20℃冰箱中冰凍保存2.5個(gè)月后取出化凍，進(jìn)行分析。結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，氯吡格雷血漿樣品在室溫下放置9 h、反復(fù)3次凍融、冰凍放置1.5個(gè)月和2.5個(gè)月條件下均穩(wěn)定性良好。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（±s，n＝5）

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（±s，n＝5）

0.01 0.60 9.0 0.010 46±0.000 54 0.644 6±0.033 8.847±0.24 5.2 5.2 2.7 0.0103 5±0.000 55 0.634 5±0.047 8.923±0.29 5.3 7.5 3.3 71.83±5.03 74.24±1.48 72.90±2.99 7.0 2.0 4.1 104.5±3.66 111.3±2.67 98.8±1.88 3.5 2.4 1.9

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 2Results of stability test（±s ，n＝3）

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s ，n＝3）Tab 2Results of stability test（±s ，n＝3）

立即測(cè)定室溫放置9 h反復(fù)凍融3次冰凍1.5個(gè)月冰凍2.5個(gè)月0.010 45 0.009 692 0.010 35 0.010 39 0.011 39 4.2-3.3 3.2 3.7 3.0 0.669 2 6.326 0.594 2 0.583 7 0.679 7 11.3 5.2－1.2－2.9 2.5 8.567 8.900 9.091 8.723 8.706－5.0－1.4 0.8－3.3－7.3

3 結(jié)果

3.1 藥-時(shí)曲線

20名健康男性志愿者隨機(jī)交叉單劑量口服硫酸氫氯吡格雷片受試制劑或參比制劑75 mg后，平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 20名健康志愿者單劑量口服2種硫酸氫氯吡格雷片75 mg后的平均藥-時(shí)曲線Fig3 Mean plasma concentration-time curves of clopidogrel in 20 healthy volunteers after single oral dose of Clopidogrel hydrogen sulfate tablets 75 mg

3.2 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用BAPP 3.0軟件，以非房室依賴型方法進(jìn)行計(jì)算。cmax和tmax為實(shí)測(cè)值；消除相半衰期（t1/2）、清除率（CL/F）、表觀分布容積（Vd/F）、曲線下面積（AUC）等分別用公式計(jì)算。有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

3.3 生物等效性評(píng)價(jià)

20名健康男性志愿者口服硫酸氯吡格雷片受試制劑或參比制劑75 mg后，相對(duì)生物利用度以氯吡格雷計(jì)為（108.9±52.2）%。對(duì)受試制劑和參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax、AUC0～36h經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，先用雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析，再進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，氯吡格雷的cmax、AUC0～36h、AUC0～∞在 2 制劑間均無(wú)顯著性差異，均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑中氯吡格雷的cmax、AUC0～36h、AUC0～∞的 90%置信區(qū)間分別為 96.0%～130.2%、84.5%～117.5%、86.2%～118.2%。對(duì)氯吡格雷的tmax采用非參數(shù)法（Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)）檢驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，2制劑氯吡格雷的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，受試制劑與參比制劑生物等效。

表3 20名健康志愿者單劑量口服2種硫酸氫氯吡格雷片75 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝20）Tab3 Main pharmacokinetics parameters of clopidogrel in 20 healthy volunteers after single oral dose of Clopidogrel hydrogen sulfate tablets 75 m（g±s ，n＝20）

表3 20名健康志愿者單劑量口服2種硫酸氫氯吡格雷片75 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝20）Tab3 Main pharmacokinetics parameters of clopidogrel in 20 healthy volunteers after single oral dose of Clopidogrel hydrogen sulfate tablets 75 m（g±s ，n＝20）

t1/2/h tmax/h cmax/ng·mL-1 CL/F/L·h-1 Vd/F/L AUC0～36 h/ng·h·mL-1 AUC0～∞/ng·h·mL-1 F/%6.6±4.9 0.64±0.21 1.724±1.38 51.87±34.12 461.4±354.4 1.996±1.223 2.114±1.209 108.9±52.2 6.3±7.0 0.68±0.27 1.752±1.856 53.58±33.2 436.3±449.3 2.112±1.493 2.177±1.500

4 討論

氯吡格雷作為一種血小板聚集抑制劑，在臨床上廣泛應(yīng)用。但由于氯吡格雷是一種前體藥物，在肝臟代謝后，血漿中大約85%是對(duì)血小板聚集并無(wú)影響的羧酸鹽衍生物，母體化合物的血漿濃度很低，所以檢測(cè)困難。常見(jiàn)測(cè)定方法主要有高效液相色譜法和LC-MS法[2，3]，但均具有優(yōu)缺點(diǎn)。本研究建立以LC-MS法測(cè)定人血漿中氯吡格雷濃度的方法，靈敏度高、專屬性好、分析時(shí)間短，滿足氯吡格雷濃度分析及測(cè)定生物利用度的要求。

目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于氯吡格雷生物等效性的報(bào)道，本研究中，20名健康受試者單劑量口服2種氯吡格雷制劑75 mg后，2組之間各主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明2種制劑具有生物等效性。20例受試者的cmax和AUC0～36h個(gè)體間的差異較大，但同一受試者服用受試制劑或參比制劑的cmax和AUC0～36h較相近，這提示氯吡格雷存在一定的個(gè)體差異，這一特點(diǎn)在臨床使用時(shí)應(yīng)加以注意。

[1]Geiger J，Brich J，Honig-Liedl P，et al.Specific impairment of human platelet P2Y（AC）ADP receptor-mediated signaling by the antiplatelet drug clopidogrel[J].Arteriascler Thromb Vascbiol，1999，25（Suppl 2）：S9.

[2]季宏建，周小華，鄒建軍，等.LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氯吡格雷的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥房，2009，20（8）：584.

[3]樊宏偉，鄒建軍，林 松，等.LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中氯吡格雷及其羧酸代謝物的濃度[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2008，27（11）：811.