HPLC法測(cè)定增液承氣口服液中5種蒽醌類衍生物的含量

王愛英，王勤（1.甘肅張掖市人民醫(yī)院，張掖市734000；2.甘肅張掖市食品藥品檢驗(yàn)所，張掖市734000）

增液承氣口服液是在增液承氣湯的基礎(chǔ)上創(chuàng)制而成，由玄參、地黃、麥冬、大黃等4味中藥材組成。增液承氣湯出自清代醫(yī)家吳鞠通《溫病條辨·中焦篇》[1]，具有甘涼濡潤(rùn)、滋陰增液、軟堅(jiān)降泄、通腑泄熱之功效，用于溫病陽明腑實(shí)兼陰液虧損之證[2]。臨床上主要用于治療中老年習(xí)慣性便秘[3]、陰虛腸燥便秘[4]、慢性呼吸衰竭[5]、慢性支氣管炎急性發(fā)作[6]、流行性出血熱少尿期[7]等癥，療效確切。隨著增液承氣湯在臨床上的廣泛應(yīng)用，為便于患者服用和攜帶方便，筆者將其研制開發(fā)為增液承氣口服液，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其中5種蒽醌類衍生物進(jìn)行測(cè)定，以達(dá)到控制其內(nèi)在質(zhì)量的目的。

1 儀器與試藥

Agilent1100型HPLC儀系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；Metler-D2025型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS3120A型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201007，含量以98.0%計(jì)，以五氧化二磷為干燥劑干燥12 h后用）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201017）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司）；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純；增液承氣口服液（甘肅張掖市人民醫(yī)院自制，批號(hào)：20100302、20100701、20100902、20100903、20101101）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；以外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)含量測(cè)定無干擾；理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備[8]

分別精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品8.38 mg、大黃酸對(duì)照品8.78 mg、大黃素對(duì)照品8.52 mg、大黃酚對(duì)照品8.70 mg、大黃素甲醚對(duì)照品4.78 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成每1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各約80 μg，大黃素甲醚約40 μg的溶液，作為對(duì)照品貯備液；分別精密量取上述對(duì)照品貯備液各2 mL，混勻，即得混合對(duì)照品溶液（每1 mL含蘆薈大黃素16.76 μg、大黃酸17.56 μg、大黃素17.04 μg、大黃酚17.40 μg、大黃素甲醚9.56 μg）。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品2 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲（工作頻率：40 kHz，功率：250 W）處理2 min，再加三氯甲烷15 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方制備工藝制成缺大黃的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得蘆薈大黃素的回歸方程為Y＝4 739.67X+3.28（r＝0.999 6，n＝5）、大黃酸的回歸方程為Y＝3 959.48X+2.32（r＝0.999 8，n＝5）、大黃素的回歸方程為Y＝3 200.47X+6.94（r＝0.999 9，n＝5）、大黃酚的回歸方程為Y＝4 992.46X+32.29（r＝0.999 9，n＝5）、大黃素甲醚的回歸方程為Y＝4 730.59X－1.71（r＝0.999 7，n＝5）。結(jié)果表明，5種成分進(jìn)樣量分別在0.067～0.335、0.070～0.351、0.068～0.341、0.070～0.348、0.038～0.191 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.36%、0.63%、0.95%、1.02%、1.81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20100902）適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為 0.56、0.44、0.81、0.35、0.27 mg·mL-1，RSD分別為1.29%、0.87%、0.54%、0.75%、1.88%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.54、0.44、0.82、0.37、0.26 mg·mL-1，RSD分別為1.13%、0.98%、0.91%、1.52%、1.97%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：20100902）適量，共9份，每3份為一組，各加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定樣品含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表1 Continued Tab1

2.10 樣品含量測(cè)定

取5批樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液適量，經(jīng)0.45μm針筒過濾器過濾，精密吸取10μL進(jìn)樣，用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種蒽醌類衍生物的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

在流動(dòng)相的優(yōu)化中，選用了乙腈、甲醇、磷酸系統(tǒng)的不同配比（80∶20、85∶15和88∶12）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果隨著乙腈、甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，蒽醌類衍生物的保留時(shí)間相對(duì)減少；當(dāng)以甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）為流動(dòng)相時(shí)，能夠獲得較好的分離效果和較短的分離時(shí)間，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，所以選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，從DAD檢測(cè)器收集到的信息可知，蒽醌類衍生物在（225±2）、（254±2）、（428±2）nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，但從三維圖譜結(jié)果來看，（254±2）nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值較其他兩處大，故在上述色譜條件下確定254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，5批增液承氣口服液中的5個(gè)指標(biāo)性成分含量差異較大，這可能與原料的質(zhì)量和生產(chǎn)工藝有關(guān)。根據(jù)單味藥大黃的含量限度，結(jié)合本制劑中大黃所加量和制劑工藝，建議本品總蒽醌的含量限度為：本品每1 mL含大黃以5種蒽醌類衍生物的總量計(jì)，不得少于2.0 mg。

本試驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，經(jīng)三氯甲烷提取后可排除其他非測(cè)定物質(zhì)的干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制手段。

[1]楊 進(jìn).溫病條辨[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996：201-207.

[2]楊端芬.增液承氣湯治療小兒病毒性肺炎88例[J].四川中醫(yī)，2001，19（3）：60.

[3]牛桂珍.增液承氣湯加減治療中老年習(xí)慣性便秘的療效觀察[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2006，26（10）：1 432.

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[6]簡(jiǎn)小兵.增液承氣湯治療慢性支氣管炎急性發(fā)作32例[J].山東中醫(yī)雜志，2003，22（5）：65.

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[8]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22.