HPLC指紋圖譜結(jié)合系統(tǒng)聚類分析法對(duì)靈芝孢子油質(zhì)量的研究

馮柏康，李其鳳，李衛(wèi)民，肖 飛（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州市 510405）

靈芝孢子油是以靈芝Ganoderma lucidum（Leysds.Fr.）Karst.在生長成熟期產(chǎn)生的孢子為原料，采用超臨界CO2技術(shù)獲得的提取物?，F(xiàn)代藥理研究證明，靈芝孢子油具有多種生物活性。目前，在已上市的靈芝孢子油中，多以靈芝總?cè)谱鳛楫a(chǎn)品的功效性成分，大部分廠家在測(cè)定該成分時(shí)采用的是分光光度法。在試驗(yàn)應(yīng)用中，筆者發(fā)現(xiàn)這種方法的專屬性、穩(wěn)定性及重復(fù)性均較差，測(cè)定結(jié)果難以準(zhǔn)確反映靈芝孢子油中三萜類成分的含量。同時(shí)，靈芝孢子油中是否含有靈芝三萜在學(xué)術(shù)界仍存在一定的爭議，靈芝孢子油的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)仍需進(jìn)一步深入研究。鑒于此，筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[1]，對(duì)靈芝孢子油進(jìn)行分析，建立靈芝孢子油HPLC指紋圖譜[2]，嘗試為靈芝孢子油的質(zhì)量控制提供一種新思路；并采用系統(tǒng)聚類法[3，4]對(duì)樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，考察不同采收時(shí)間、產(chǎn)地及破壁工藝對(duì)靈芝孢子油質(zhì)量的影響。

1 儀器與試藥

2695型HPLC儀、2420型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、WATERS EMPOWER色譜工作站（美國Waters公司）。

甲醇、異丙醇為色譜純；甘油三油酸酯對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111692-200901）；樣品由廣州中醫(yī)藥大學(xué)首席教授徐鴻華提供并鑒定，為靈芝菌科靈芝G.lucidum（Leysds.Fr.）Karst.破壁孢子的超臨界CO2提取物，根據(jù)其產(chǎn)地、采收時(shí)間、破壁工藝的差異按表1進(jìn)行編號(hào)（由于涉及到商業(yè)秘密，樣品的3個(gè)產(chǎn)地分別以字母開頭的L、P、J代替，破壁工藝則以數(shù)字1和2代替）。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝孢子油供試品溶液的制備

取靈芝孢子油20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇-異丙醇（40∶60）溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 參照峰的選擇

靈芝孢子油氣-質(zhì)聯(lián)用法的分析結(jié)果顯示，甘油三油酸酯在靈芝孢子油中含量較高，也較為穩(wěn)定，故選用甘油三油酸酯峰作為參照峰。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：LiChrospher RP-18e（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-異丙醇（B），梯度洗脫（洗脫順序見表2）；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)器漂移管溫度：60 ℃；增益：135；壓力：25 Psi。理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計(jì)算不小于3 000。

2.4 測(cè)定方法

分別取各批靈芝孢子油供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄1 h的色譜圖，即得。

表1 19批靈芝孢子油原料的編號(hào)Tab1 The batch number of 19 batches of G.lucidum spore oil raw material

表2 梯度洗脫順序Tab2 Gradient elution processes

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一靈芝孢子油供試品溶液（p0701）適量，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，各供試品共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間無明顯變化（RSD＜3%），表明本方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一靈芝孢子油供試品溶液（p0701）適量，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，24 h內(nèi)各供試品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯變化（RSD＜3%），表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批靈芝孢子油樣品（p0701）適量，共6份，按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各供試品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯變化（RSD＜3%），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 HPLC指紋圖譜的建立

取各批靈芝孢子油樣品適量，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示個(gè)別供試品的圖譜差異比較大。19批靈芝孢子油的HPLC指紋圖譜見圖1。

2.7 系統(tǒng)聚類分析

從圖1可見，19批靈芝孢子油并不完全一致。為尋找對(duì)靈芝孢子油質(zhì)量影響的主要因素，現(xiàn)采用系統(tǒng)聚類分析法對(duì)樣品HPLC指紋圖譜中各特征峰進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

從圖2可見，上述19批靈芝孢子油可分為兩大類，具體見表3。

3 分析

3.1 產(chǎn)地分析

圖1 19批靈芝孢子油的HPLC指紋圖譜Fig1 HPLC fingerprint of 19 batches of G.lucidum spore oil

圖2 離差平方和法對(duì)歐氏距離的聚類樹形圖Fig2 Clustering dendrogram of euclidean distance using sum of deviations squre method

表3 19批靈芝孢子油樣品聚類分析結(jié)果Tab3 Results of cluster analysis of 19 batches of G.lucidum spore oil

圖2顯示，L、P、J產(chǎn)地的樣品在聚類樹形圖中混合在一起，沒有明確分開。提示不同產(chǎn)地之間靈芝孢子油的差別并不太大，初步推斷產(chǎn)地對(duì)靈芝孢子油的質(zhì)量不產(chǎn)生決定性影響。

3.2 采收時(shí)間分析

從圖2可見，采用工藝1破壁的靈芝孢子，12、1、2、3、4、5、6月采收的孢子均聚于同一大類，而9、10、11月的聚于另一大類。由此推斷，上一年12月－本年上半年（6月前）的孢子是基本相似的，而9、10、11月采收的孢子則與上述差別較大。較為可惜的是現(xiàn)無7、8月的數(shù)據(jù)，未能完全說明整年的變化。

3.3 破壁工藝分析

圖2還顯示，采用破壁工藝2所得的靈芝孢子在第一大類中是自成一小類的，說明破壁工藝對(duì)孢子油質(zhì)量的影響是明顯的。

4 討論

從上述分析結(jié)果可見，同一批靈芝孢子原料在不同的破壁工藝下，所獲得的靈芝孢子油有著顯著的區(qū)別，破壁工藝對(duì)控制產(chǎn)品一致性的影響是明顯的，因此廠家必須在充分試驗(yàn)后確定固定的破壁工藝。

從現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果看，上一年12月－本年上半年（6月前）的靈芝孢子是基本相似的，而9、10、11月采收的靈芝孢子則與上述差別較大。

針對(duì)目前靈芝孢子油有效成分尚不明確的現(xiàn)狀，下一步的研究工作需通過對(duì)靈芝孢子油藥理學(xué)與臨床研究客觀反映上述兩大類靈芝孢子油的藥理效能，確定靈芝孢子油最適宜的采收時(shí)間、破壁工藝等，從而穩(wěn)定靈芝孢子油原料的來源；然后對(duì)靈芝孢子油建立標(biāo)準(zhǔn)化提取物的指紋圖譜，解決產(chǎn)品的質(zhì)量控制問題，最終使產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本穩(wěn)定在同一水平上，達(dá)到控制中間體、成品的一致性，減少批間差異的目的。

[1]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[J].中成藥，2000，22（10）：671.

[2]周玉新.中藥指紋圖譜研究技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：8.

[3]游元元，萬德光，裴 謹(jǐn)，等.不同品種桑葉高效液相指紋圖譜的聚類分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（11）：2 661.

[4]范俊安，夏永鵬，邱宗蔭，等.重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅰ）——不同因素的影響及牡丹皮最適宜種植條件選擇[J].中國藥房，2009，20（21）：1 667.