正交試驗優(yōu)選紫冰乳膏的提取工藝Δ

馬 瑛，姚鴻萍，龐成森，王 娟（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安市 710061）

正交試驗優(yōu)選紫冰乳膏的提取工藝Δ

馬 瑛＊，姚鴻萍，龐成森，王 娟（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安市 710061）

目的：優(yōu)選紫冰乳膏的最佳提取工藝。方法：以左旋紫草素含量為評價指標(biāo)，以溶劑用量、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為8倍量的95%乙醇，在60℃條件下提取3次，每次1h。結(jié)論：優(yōu)選的工藝合理、可行，制得的制劑質(zhì)量穩(wěn)定。

紫冰乳膏；左旋紫草素；高效液相色譜法；正交試驗；提取工藝

紫草作為藥用紫草的主要來源，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。味苦，性寒。有涼血、活血、解毒和透疹的功能，主治血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等[1]。

以紫草為主藥的外用燒傷制劑多以麻油油煎，但油性較大，不易吸收，使用和攜帶不方便，又容易污染衣物。因此，筆者研制了O/W的紫冰乳膏，由紫草、大黃、地榆、冰片等組成。主要用于治療Ⅰ、Ⅱ度燒傷、燙傷、傷口感染、褥瘡等多種外科疾病和皮膚病。它對皮膚表面分泌物具有親合力，有減少創(chuàng)面滲出、促進(jìn)創(chuàng)面愈合修復(fù)的作用。為充分提取藥材中有效成分，本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法和正交試驗，以左旋紫草素含量為評價指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

Waters 510型HPLC儀，包括486型紫外檢測器、510型HPLC泵（美國Waters公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LLEGRATMX-22R型高速低溫離心機(jī)（美國貝克曼公司）。

紫草飲片（購自西安中藥飲片廠，產(chǎn)地：新疆，批號：20060715）；左旋紫草素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0769-9903）；紫冰乳膏（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部自制）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 左旋紫草素含量測定

2.1.1 色譜條件色譜柱：Kromasil C18（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：516nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.左旋紫草素對照品；B.供試品

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取左旋紫草素對照品適量，加甲醇稀釋成每1mL含4.8μg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取自制紫冰乳膏1g，精密稱定，加適量甲醇超聲30min使溶解，過濾，濾渣再加適量甲醇溶解，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并用甲醇定容，搖勻，低溫離心機(jī)離心（3000r·min-1）10min，作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成濃度分別為0.048、0.096、0.192、0.288、0.384、0.432μg·mL-1的溶液，分別精密吸取10μL，注入色譜儀，記錄峰面積。以左旋紫草素檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝395549X+3730（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，左旋紫草素檢測濃度在0.048～0.432μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.06%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣1次，每次10μL，記錄峰面積，觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果，RSD＝2.56%（n＝5），表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 按供試品溶液制備方法，平行制備3份樣品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣3次，每次10μL，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.84%（n＝9），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定樣品（含量：7.2μg·g-1）6份，每份1g，分別精密加入濃度為4.8μg·mL-1的對照品溶液1.5mL，按供試品溶液制備方法制備，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為98.94%，RSD＝1.68%（n＝6）。

2.2 提取工藝優(yōu)選

紫草的主要化學(xué)成分為萘醌類色素，其親脂性強(qiáng)，易溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等溶劑，難溶于水。且此類色素具有熱不穩(wěn)定性，60℃以上顏色由紅色變?yōu)樽虾谏?，且隨溫度升高其變化速度加快[2]。一般采用植物油中浸泡或用95%乙醇提取，壓榨，過濾得油提液，可最大程度提取紫草中有效成分，但考慮油提成本較高，因此通過正交試驗優(yōu)選紫草的醇提工藝。

本試驗采用L9（34）正交試驗設(shè)計，從提取溫度（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C）、提取次數(shù)（D）等不同因素、水平考察，以左旋紫草素含量為指標(biāo)，優(yōu)選提取工藝。因素水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2、表3可知，因素A、B對工藝有顯著性差異（P＜0.05），各因素影響大小依次為A＞B＞D＞C，優(yōu)選的工藝為A1B2C1D3，即提取溫度60℃，提取時間1h，溶劑用量8倍量，提取次數(shù)3次。

2.3 工藝驗證

按照優(yōu)選的生產(chǎn)工藝制備紫冰乳膏樣品5批，精密稱取樣品1g，按供試品溶液制備方法制備，照上述色譜條件測定，記錄峰面積，計算左旋紫草素含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝5）Tab 4Results of samples determinatio（nn＝5）

3 討論

2010年版《中國藥典》（一部）中采用分光光度法測定紫草中羥基萘醌總色素的含量，采用HPLC法測定β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量[3，4]。試驗中發(fā)現(xiàn)，乳膏劑用石油醚提取得到的殘渣很難用流動相溶解完全，不適合以阿卡寧的含量作質(zhì)控指標(biāo)，故采用HPLC法對紫冰乳膏中左旋紫草素進(jìn)行含量測定。

HPLC法測定左旋紫草素含量常采用的流動相為甲醇-0.025mol·L-1磷酸（85∶15）[5]、甲醇-水（75∶25）[6]。經(jīng)試驗，選用甲醇-水（80∶20）作為流動相，在516nm波長處基線平穩(wěn)，出峰時間較短，左旋紫草素色譜峰無其他雜質(zhì)干擾。經(jīng)方法學(xué)考察，認(rèn)為本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于紫冰乳膏的質(zhì)量控制。

正交試驗設(shè)計研究表明，對紫草提取工藝影響最大的是提取溫度，其次為提取時間，提取次數(shù)影響不大。故結(jié)合實際工作，確定最佳提取工藝為藥材加8倍95%乙醇，提取溫度為60℃，提取時間為1h，提取3次。驗證試驗表明，在此提取條件下有效成分的損失最小，同時可達(dá)到較高的提取效率，工藝穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 陰 健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京：學(xué)苑出版社，1993：6431.

[2] 趙雪梅，王桂玲，費洪榮，等.紫草有效成分的提取及其抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24（4）：36.

[3] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：320.

[4] 曾祖平，王子君，王 宏，等.HPLC法測定紫其中β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量[J].中國藥房，2011，22（15）：1407.

[5] 杜春雙，宋曉坤.紫黃膏中左旋紫草素的含量測定[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（10）：1468.

[6] 張善玉，樸桂蘭，李 梅，等.HPLC法測定紫草涂膜劑中紫草素的含量[J].中國野生植物資源，2004，23（1）：58.

Optimization of the Extraction Technology of Zibing Cream by Orthogonal Experiment

MA Ying，YAO Hong-ping，PANG Cheng-sen，WANG Juan（Dept.of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Medical College，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Zibing cream.METHODS：The extraction technology of Zibing cream was optimized by orthogonal experiment using content of L-shikonin as index and with amount of solvent，extraction time，extraction temperature，extraction times as factors.RESULTS：The optimal extraction was as follows：8fold 95%alcohol，soaking and extracting for 3times at 60℃，1h each time.CONCLUSION：The technology is reasonable and feasible，and prepared cream is stable in quality.

Zibing cream；L-shikonin；HPLC；Orthogonal experiment；Extraction technology

R283.621；R284.2

A

1001-0408（2011）35-3296-02

Δ陜西省科技研究發(fā)展攻關(guān)項目（2004K18-G9）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：029-85323243。E-mail：maying6704@sina.com

2011-06-02

2011-07-20）