丹參制劑中丹參不同提取方法的合理性評(píng)價(jià)Δ

鄭 琴，胡鵬翼，楊 明，岳鵬飛，伍振峰，王 芳（江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌市330004）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。近年來，隨著對(duì)丹參基礎(chǔ)及臨床藥理學(xué)研究的不斷深入，以丹參為主藥的單方或復(fù)方制劑品種繁多，如丹參片、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸、冠心丹參片、冠心丹參膠囊等。這些品種均由丹參、三七加減藥味組成，其功能主治大致相同，均用于治療心腦血管疾病。但其中丹參的提取工藝卻不盡相同，如丹參片、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸中的丹參采用熱回流提取，而冠心丹參片采用先滲漉再熱回流提??；復(fù)方丹參滴丸采用丹參與三七合煎，而丹參片、復(fù)方丹參片、冠心丹參片均采用丹參單提[1]。提取工藝不同可能導(dǎo)致藥效物質(zhì)不同，從而影響最終產(chǎn)品的療效[2，3]。本文通過比較不同工藝對(duì)丹參有效成分（丹參酮ⅡA、丹酚酸B）的影響，通過對(duì)濃縮過程中丹參有效成分含量的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，找出影響有效成分含量的關(guān)鍵步驟，為改進(jìn)丹參制劑中丹參的生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)，從而保證制劑的質(zhì)量和療效。

1 儀器與試藥

1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國Aligent公司）；UV2500紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；B-490BVCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華儀器有限公司）；KDM控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器有限公司）；BS124S分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ZRS-8G智能溶出儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

丹參飲片（購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉榮華教授鑒定為唇形科植物丹參S.miltiorrhigaBge.的干燥根及根莖）；丹參酮ⅡA、丹酚酸B對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110766-200417、852-9903）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

2 方法

2.1 不同提取方法對(duì)丹參制劑中丹參有效成分的影響[1]

2.1.1 丹參片中丹參的提取 取丹參45 g，加8倍量90%乙醇，75℃回流1.5 h，濾過，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2）；藥渣加8倍量水煎煮1 h，濾過，濾液50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2），即得。

2.1.2 復(fù)方丹參片中丹參的提取 取丹參45 g，加8倍量95%乙醇，75℃回流1.5 h，濾過，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2）；藥渣加8倍量50%乙醇，熱回流1.5 h，濾過，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2）；藥渣加8倍量水熱回流2 h，濾過，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2），即得。

2.1.3 復(fù)方丹參滴丸中丹參的提取 取丹參45 g、三七粗粉14.1 g，加8倍量水熱回流1.5 h，濾過，藥渣繼續(xù)加8倍量水熱回流1.5 h，濾過，合并2次提取液，50℃水浴中蒸發(fā)至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.1），加乙醇至溶液含醇70%，4℃靜置12 h，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，50 ℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2），即得。

2.1.4 冠心丹參片中丹參的提取 取丹參（中粉）45 g，用90%乙醇作溶劑進(jìn)行滲漉，流速為1 mL·min-1，收集滲漉液約315 mL，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2）；藥渣加8倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，濾過，濾液于50℃減壓濃縮至稠膏（20℃，相對(duì)密度為1.2），即得。

2.1.5 色譜條件 （1）丹參酮ⅡA：色譜柱為Hypemil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（73∶27），檢測(cè)波長為270 nm，流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。（2）丹酚酸B：色譜柱為Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶甲酸水（1∶59）＝25∶10∶65，檢測(cè)波長為286 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.6 線性關(guān)系考察 （1）精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品4.80 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度作為母液。分別取適量母液，加甲醇稀釋至濃度為4.80、9.60、19.20、38.40、57.60、96.0 μg·mL-1的溶液，作為丹參酮ⅡA系列對(duì)照品溶液。分別取上述溶液各20 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝105.41X－19.951（r＝0.999 5，n＝6）。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.096～1.920 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。（2）精密稱取丹酚酸B對(duì)照品5.01 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度作為母液。分別取適量母液，加流動(dòng)相稀釋至濃度為5.01、10.02、20.04、30.06、40.08、50.10 μg·mL-1的溶液，作為丹酚酸B系列對(duì)照品溶液。分別取上述溶液各20 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝19.971X－1.243 9（r＝0.999 6，n＝6）。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.1～1.0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2 濃縮溫度對(duì)提取液中有效成分穩(wěn)定性的影響

取“2.1”項(xiàng)下復(fù)方丹參片中丹參95%醇提液5 mL（若干份），分置若干個(gè)試管中，再置于50、70℃水浴中，分別于4、8、12 h取出，按上述色譜條件測(cè)定丹參酮ⅡA含量。分別取“2.1”項(xiàng)下復(fù)方丹參滴丸中丹參水提液、丹參片中丹參水提液5 mL（若干份），分置若干個(gè)試管中，再置于50、70℃水浴中，分別于4、8、12 h取出，按上述色譜條件測(cè)定丹酚酸B含量。

2.3 丹參提取液濃縮前后有效成分含量變化

2.3.1 丹參酮ⅡA含量的變化 將丹參95%和90%醇提液濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定丹參酮ⅡA的含量；將丹參50%醇提液濾過，取續(xù)濾液，同法測(cè)定丹參酮ⅡA的含量。精密稱取95%、90%醇提取濃縮得到的丹參浸膏約0.4 g，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，同法測(cè)定丹參酮ⅡA的含量；精密稱取50%醇提取濃縮得到的丹參浸膏約0.8 g，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，同法測(cè)定丹參酮ⅡA的含量。

2.3.2 丹酚酸B含量的變化 精密量取丹參95%、90%醇提液續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定丹酚酸B的含量；將丹參的50%醇提液及水提液濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，同法測(cè)定丹酚酸B的含量。另精密稱取90%、95%醇提取濃縮得到的丹參浸膏約1.0 g，置10 mL量瓶中，加水適量，超聲處理30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，同法測(cè)定丹酚酸B的含量；精密稱取50%醇及水提取濃縮得到的丹參浸膏約0.5 g，置25 mL量瓶中，加水適量，超聲處理30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，同法測(cè)定丹酚酸B的含量。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法下各丹參制劑的丹參提取液中有效成分的含量比較

不同方法提取的丹參提取液，有效成分的含量差異較大。滲漉法提取的丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量均最高。不同提取液中丹參酮ⅡA含量見圖1；不同提取液中丹酚酸B含量見圖2。

3.2 濃縮溫度對(duì)提取液中丹參酮ⅡA、丹酚酸B穩(wěn)定性的影響

丹參酮ⅡA在95%醇提液中較穩(wěn)定，溫度對(duì)其影響較小。丹酚酸B在水溶液中穩(wěn)定性較差，溫度越高損失越大，因此選擇濃縮的溫度為50℃，從而降低丹酚酸B的含量損失。丹參片、復(fù)方丹參片、冠心丹參片中丹參均采用單提的方法，而復(fù)方丹參滴丸采用丹參和三七合提的方法，溫度對(duì)丹參和三七合提液中丹酚酸B的穩(wěn)定性影響較丹參單提液中丹酚酸B的穩(wěn)定性影響小，因此推斷三七能增加丹酚酸B的穩(wěn)定性。溫度對(duì)丹參酮ⅡA、丹酚酸B穩(wěn)定性的影響分別見圖3、圖4。

3.3 丹參提取液濃縮后有效成分含量變化

濃縮對(duì)丹酚酸B含量變化影響較大，各種濃縮液中其含量均不同程度的降低。復(fù)方丹參片提取液中的丹酚酸B則相對(duì)穩(wěn)定，濃縮后損失率為3.53%。而對(duì)于丹參酮ⅡA，則醇濃度越高其損失量越?。旱⑵?、冠心丹參片均采用90%醇提，濃縮后丹參酮ⅡA的損失率分別為15.29%、25.87%；復(fù)方丹參片采用95%醇提，濃縮后丹參酮ⅡA基本無損失。濃縮對(duì)丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量的影響分別見圖5、圖6。

4 討論

丹參中的有效成分丹酚酸B含有多個(gè)酚羥基、酯鍵以及羥基，在受熱情況下容易發(fā)生分解、氧化以及脫羥基的反應(yīng)。有文獻(xiàn)表明，丹參藥材水提液隨著加熱時(shí)間的延長，丹酚酸B等大分子物質(zhì)水解為丹參素，含量降低[4]。本試驗(yàn)也表明，由于滲漉法無需加熱，故提取的丹酚酸B的含量明顯高于熱回流法，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；由于丹酚酸B在水溶液中穩(wěn)定性較差[5，6]，因此丹參提取液濃縮后丹酚酸B含量損失較大，建議可采用低溫濃縮或減少受熱時(shí)間的噴霧或微波干燥。

2010年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定丹參藥材中含丹參酮ⅡA不得少于0.20%。據(jù)此，按復(fù)方丹參片處方推算，薄膜衣片每片相當(dāng)于丹參藥材0.45 g，則丹參酮ⅡA含量的理論值應(yīng)為每片不低于0.9 mg，而復(fù)方丹參片的規(guī)定值為每片不低于0.2 mg，僅為理論值的22%。同樣，冠心丹參膠囊中丹參酮ⅡA為每粒不低于0.3 mg，為理論值的75%，這可能與冠心丹參片中丹參活性成分的提取率較高有關(guān)，且本文試驗(yàn)結(jié)果也證明了丹參采用滲漉法提取，其丹參酮ⅡA提取率較高。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7，8]，丹參酮ⅡA醇提液隨著溫度升高，降解速度加快；隨著醇濃度降低，降解速度加快。因此，復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA采用95%醇提，醇濃度較高，丹參酮ⅡA較為穩(wěn)定，濃縮時(shí)含量變化較?。欢谛牡⑵?、丹參片提取的乙醇濃度為90%，醇濃度稍低，因此濃縮時(shí)丹參酮ⅡA的含量明顯降低。

滲漉法提取的丹參酮ⅡA、丹酚酸B的含量均最高，且丹參酮ⅡA在95%乙醇中較穩(wěn)定，因此丹參的提取采用95%乙醇滲漉或動(dòng)態(tài)逆流冷提工藝，再采用不同濃度的醇或水提，并在低溫（＜50℃）下進(jìn)行濃縮，有利于保證有效成分的含量和穩(wěn)定性。

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