呋喃蟲酰肼對舞毒蛾解毒酶活力的影響1)

李 慧 嚴(yán)善春 曹傳旺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

舞毒蛾(Lymantria dispar)是我國重要的森林害蟲，同時又是國際上重要的檢疫性有害生物，嚴(yán)重影響木材外貿(mào)出口［1-3］。目前，化學(xué)藥劑防治仍然是國內(nèi)外對舞毒蛾的主要控制措施。呋喃蟲酰肼(JS118)是我國具有知識產(chǎn)權(quán)的一種高效促蛻皮仿生殺蟲劑［4-5］，其主要利用昆蟲生長過程中產(chǎn)生的激素物質(zhì)，干擾昆蟲正常的生長發(fā)育。研究表明，呋喃蟲酰肼對鱗翅目害蟲如甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、小菜蛾、二化螟等都表現(xiàn)出較高的生物活性，同時對非靶標(biāo)生物有很高的安全性，具有低藥量、持續(xù)長、穩(wěn)定、高效，對人畜安全等特點［6-7］。目前，尚未有將呋喃蟲酰肼用于防治林木害蟲的相關(guān)報道。

昆蟲解毒酶主要包括羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶O-脫甲基(MFOs)［8-9］。磷酸酯酶分為酸性磷酸酯酶(ACP)和堿性磷酸酯酶(ALP)，是一種與昆蟲抗性有關(guān)的重要水解酶［10］。昆蟲解毒酶能被各種外源化合物誘導(dǎo)，使昆蟲在受到嚴(yán)重的化學(xué)環(huán)境壓力作用時迅速做出反應(yīng)，從而存活下來［11］。因此昆蟲的解毒酶在殺蟲劑代謝、昆蟲抗藥性等方面都具有重要作用。本研究以舞毒蛾幼蟲為對象，從生化水平探討了亞致死濃度呋喃蟲酰肼對舞毒蛾的生物活性及對其幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響，為應(yīng)用該藥劑對舞毒蛾的防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲與飼養(yǎng)

2010年3月在東北林業(yè)大學(xué)校園及其示范林場內(nèi)采集舞毒蛾卵塊。將采回的蟲卵置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，幼蟲用人工飼料飼養(yǎng)，每天觀察并及時更換飼料，定期清理幼蟲的排泄物和食物殘渣。恒溫飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，相對濕度75%，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 供試藥劑

10%呋喃蟲酰肼懸浮劑(JS118)購自江蘇省農(nóng)藥研究所有限公司;α-乙酸萘酯、硝基苯基磷酸二鈉、巴比妥鈉、考馬斯亮藍G-250、血清白蛋白、乙二胺四乙酸均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;還原型谷胱甘肽、1-氯-2，4-二硝基苯、對硝基苯甲醚、毒扁豆堿、固藍B鹽、十二烷基硫酸鈉、苯甲基磺酰氟、二硫蘇糖醇、硫脲均購自美國Sigma公司;還原型輔酶Ⅱ四鈉購自瑞士Rocha公司;磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉及其他試劑均為分析純。

1.3 毒力測定

毒力測定采用葉片藥膜法［12-13］。用蒸餾水將10%呋喃蟲酰肼等比稀釋6個梯度，其中2、3齡幼蟲選用的質(zhì)量濃度梯度為 1.00、0.75、0.50、0.25、0.10、0.05、0.01 mg·L-1;4、5、6 齡幼蟲選用的質(zhì)量濃度梯度為 1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25、0.10 mg·L-1，以蒸餾水為對照。將未接觸過任何藥劑的白樺(Betula platyphylla Suk.)葉片浸入稀釋好的藥液中，10 s后取出，置于陰涼處晾干。用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放入透氣性良好的塑料培養(yǎng)皿(直徑d=9 cm)中。將健康、大小一致的2～6齡舞毒蛾幼蟲接到白樺葉片上，每齡每皿放入10頭，每齡每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，24 h后檢查死亡數(shù)，以毛筆輕觸幼蟲不能活動視為死亡。

1.4 亞致死濃度處理

根據(jù)毒力測定結(jié)果，用選定24 h的LC50劑量呋喃蟲酰肼處理白樺葉片，飼喂健康、大小一致，且饑餓12 h的3齡和5齡舞毒蛾幼蟲，每齡每皿放入10頭，處理方法和飼養(yǎng)條件同1.3，以蒸餾水處理作對照。分別于處理 6、12、24、36、48 h 后，挑選活潑的3齡和5齡舞毒蛾幼蟲，于冰箱中-80℃儲存，用于酶活性測定。

1.5 解毒酶活性測定

羧酸酯酶(CarE)活性：參照 Van Asperen［14］的方法略有改動。在試管中分別加入3×10-4mol·L-1的α-乙酸萘酯底物(含1∶1 毒扁豆堿)5.0 mL，0.04 mol·L-1、pH 值7.0 磷酸緩沖液0.8 mL，酶液0.2 mL，立即混勻，在30℃水浴振蕩條件下反應(yīng)30 min，然后每支試管中加入顯色劑1.0 mL，室溫下靜置30 min，于600 nm處測定OD值。以酶量(mL)為自變量，OD值為因變量，根據(jù)羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每毫升酶液生成的α-萘酚量，再根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)，計算出羧酸酯酶的比活力。酶活力單位以mol·g-1·min-1表示。

磷酸酯酶(ACP和 ALP)活性：參照Bessey等［15］的方法略作修改。ACP活性測定采用對硝基苯磷酸二鈉做底物，反應(yīng)混合物為 0.2 mol·L-1、pH 值4.6 醋酸緩沖液2.3 mL，7.5 ×10-3mol·L-1對硝基苯磷酸二鈉溶液0.5 mL和0.1 mL酶液。混勻30℃水浴反應(yīng)15 min后加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉2.0 mL終止反應(yīng)，混勻后于400 nm處測定OD值。對照中用緩沖液代替酶液。ALP活性測定，用0.4 mol·L-1，pH值9.6巴比妥鈉—鹽酸緩沖液代替0.2 mol·L-1、pH值4.6的醋酸緩沖液，其余方法同ACP活性測定。酶活力以mol·g-1·min-1表示。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性：參照Booth［16］的方法。在試管中分別加入0.066 mol·L-1、pH值7.0的磷酸緩沖液2.5 mL，0.5 mol·L-1GSH 0.3 mL，0.03 mol·L-1CDNB 0.1 mL，酶液0.1 mL，立即混勻，在27℃，于340 nm處測定5 min內(nèi)OD的變化值。酶活力單位以ΔOD·mg-1·min-1表示。

多功能氧化酶(MFOs)活性：參考Hansen等［17］方法略作修改。取 4 ×10-3mol·L-1對硝基苯甲醚 1.0 mL，0.1 mol·L-1、pH 值7.8 磷酸緩沖液0.8 mL，5 ×10-4mol·L-1NADPH-Na40.2 mL 和酶液 1.0 mL，以等體積的 0.1 mol·L-1、pH值7.8磷酸緩沖液作對照，搖勻置于37℃水浴中反應(yīng)30 min，然后在反應(yīng)體系中加入1.0 mol·L-1鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)，再加入5.0 mL氯仿萃取，靜止10 min后，在氯仿層移取3.0 mL 到另一組試管內(nèi)，再加入 0.5 mol·L-1氫氧化鈉 3.0 mL溶液萃取，靜止10 min，取水相2.0 mL于比色皿中，于400 nm處測定OD值。酶活力單位以mol·g-1·min-1表示。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

采用Bradford考馬斯亮藍G-250法［18］。

1.7 低劑量呋喃蟲酰肼對舞毒蛾各發(fā)育指標(biāo)的影響測定

采用葉片藥膜法，取用LC10和LC30劑量呋喃蟲酰肼處理的白樺葉片，飼喂剛蛻皮大小一致的3齡舞毒蛾幼蟲，每培養(yǎng)皿(直徑9 cm)1頭，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，以清水處理為對照。在其整個幼蟲發(fā)育期，均用LC10和LC30劑量呋喃蟲酰肼處理的葉片喂養(yǎng)，待幼蟲羽化為成蟲后，以5%的新鮮蜜糖水繼續(xù)喂養(yǎng)。每10頭試蟲為一組，重復(fù)3次。從4齡開始，每隔12 h觀察并統(tǒng)計各齡期的成活率、發(fā)育歷期、化蛹率、羽化率等發(fā)育指標(biāo)，直到成蟲死亡。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用POLO軟件處理分析毒力測定結(jié)果，計算致死中濃度(LC50)和低濃度(LC10和LC30)及其95%置信區(qū)間;采用SPSS17.0軟件進行方差分析，差異顯著性檢驗采用LSD法，顯著水平 α =0.05或 α=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 呋喃蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲的毒力

從表1可以看出，呋喃蟲酰肼對不同齡期的舞毒蛾幼蟲均表現(xiàn)出較高的活性，蟲齡越小，對藥劑越敏感，隨著幼蟲齡期的增長，所需藥量逐漸增加。選擇處理24 h的LC50作為試驗劑量處理3齡和5齡舞毒蛾幼蟲(LC50分別為0.369、0.842 mg·L-1)，測定呋喃蟲酰肼對其體內(nèi)解毒酶活性的影響。并選擇舞毒蛾幼蟲24 h的低濃度LC10和LC30飼喂大齡幼蟲研究呋喃蟲酰肼對其生長發(fā)育的影響。

表1 呋喃蟲酰肼對舞毒蛾各齡幼蟲的毒性

2.2 呋喃蟲酰肼對3齡舞毒蛾幼蟲解毒酶活性的影響

呋喃蟲酰肼對舞毒蛾3齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性影響明顯。從表2可以看出，呋喃蟲酰肼對3齡幼蟲CarE活性具有先激活后抑制作用，處理6～12 h，CarE活性明顯被激活，其中處理6 h時，對CarE的激活作用最強，為同期對照的1.243倍，差異極顯著(p＜0.01);24 h后CarE活性逐漸被抑制，并隨處理時間的延長，對該酶活抑制作用逐漸增強。處理過程中ACP活性明顯被抑制，并隨處理時間的延長，酶活抑制作用增強;ALP活性則表現(xiàn)為先抑制后激活再抑制作用，處理12 h，ALP活性明顯被激活，為同期對照組的1.286倍，差異極顯著(p＜0.01);24 h后，ALP活性又逐漸被抑制。

表2 呋喃蟲酰肼對3齡舞毒蛾幼蟲CarE、ACP和ALP活性的影響

從表3中可以看出，呋喃蟲酰肼對3齡舞毒蛾幼蟲體內(nèi)GSTs活性具有先激活后抑制作用，處理6 h后，處理組GSTs活性明顯高于對照組，為對照組的1.16倍，差異顯著(p＜0.05);12 h后，GSTs活性逐漸被抑制，且處理時間越長，對該酶活的抑制作用越強，與對照組相比差異均極顯著(p＜0.01)。對MFOs活性表現(xiàn)為先抑制后激活，處理6～12 h，MFOs活性被抑制，其中處理6 h時，對MFOs的活性抑制作用最強，為同期對照的0.843倍，差異極顯著(p＜0.01);從24 h起，呋喃蟲酰肼對MFOs活性具有明顯的激活作用，其中處理36 h時，MFOs激活作用最強，為同期對照的1.393倍，差異極顯著(p＜0.01)，隨處理時間的延長，藥劑對該酶活激活作用呈下降趨勢。說明呋喃蟲酰肼對3齡舞毒蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響比較復(fù)雜，對酶活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)或抑制作用。

表3 呋喃蟲酰肼對3齡舞毒蛾幼蟲GSTs和MFOs活性的影響

2.3 呋喃蟲酰肼對5齡舞毒蛾幼蟲解毒酶活性的影響

表4和表5為呋喃蟲酰肼對舞毒蛾5齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響。從表4中可以看出，5齡舞毒蛾幼蟲經(jīng)呋喃蟲酰肼處理后，6～12 h，CarE活性明顯被抑制，12 h后酶活性逐漸被激活，其中處理24 h時，處理組CarE活性明顯高于對照組，為同期對照組的 1.349 倍，差異極顯著(p＜0.01)，36 h 后CarE活性又逐漸被抑制。對ACP活性表現(xiàn)為明顯的抑制作用，且隨處理時間的延長，對ACP活性的抑制作用增強。對ALP活性表現(xiàn)為先激活后抑制，6 h時ALP活性被激活，為同期對照組的1.106 倍，差異顯著(p＜0.05)，24～48 h，ALP 活性隨著處理時間的延長而逐漸被抑制，且差異極顯著(p＜0.01)。

表4 呋喃蟲酰肼對5齡舞毒蛾幼蟲CarE、ACP和ALP活性的影響

從表5可以看出，呋喃蟲酰肼對5齡舞毒蛾幼蟲體內(nèi)GSTs和MFOs存在明顯影響。呋喃蟲酰肼對5齡舞毒蛾幼蟲體內(nèi)GSTs活性具有明顯的抑制作用，且藥劑處理時間越長，對GSTs活性抑制作用越強，均表現(xiàn)出差異顯著或極顯著(p＜0.05或p＜0.01)。對MFOs活性表現(xiàn)出先激活后抑制，24～36 h，處理組MFOs活性被激活，其中24 h時MFOs的激活作用最強，為同期對照組的1.387倍，差異極顯著(p＜0.01)，48 h時，MFOs活性開始被抑制。

表5 呋喃蟲酰肼對5齡舞毒蛾幼蟲GSTs和MFOs活性的影響

2.4 低劑量呋喃蟲酰肼對舞毒蛾生長發(fā)育的影響

由表6可以看出，呋喃蟲酰肼對舞毒蛾的生長發(fā)育具有明顯的影響。與對照相比，LC10和LC30劑量的呋喃蟲酰肼均明顯的延長了舞毒蛾幼蟲的發(fā)育時間，隨著呋喃蟲酰肼質(zhì)量濃度的增大，幼蟲的成活率明顯降低，且藥劑處理時間越長，幼蟲的成活率越低(p＜0.05)。

3 結(jié)論與討論

有研究表明，呋喃蟲酰肼對甜菜夜蛾的防效明顯優(yōu)于高效氯氰菊酯乳油［19］。李慧等［20］經(jīng)毒力測定發(fā)現(xiàn)，有機磷殺蟲劑毒死蜱對舞毒蛾3齡幼蟲在24 h的致死中濃度為5.86 mg·L-1，遠高于昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑呋喃蟲酰肼對舞毒蛾3齡幼蟲的致死中濃度0.369 mg·L-1，進一步證明呋喃蟲酰肼的低毒作用。

非甾醇蛻皮激素類殺蟲劑在昆蟲體內(nèi)的解毒代謝與GSTs和 MFOs有關(guān)［21］;周利琳等［22］研究表明蟲酰肼能夠誘導(dǎo)CarE和GSTs的活性增強。馬志卿等［23］研究表明，用沾有脫氧鬼臼毒素的小麥葉碟飼喂粘蟲后，明顯抑制其ACP活性，而ALP活性則表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的變化過程。李曉濤等［24］研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量氟蟲腈對二化螟4齡幼蟲體內(nèi)MFOs活性表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)。本研究表明呋喃蟲酰肼能有效影響舞毒蛾3齡和5齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性，處理初期，呋喃蟲酰肼刺激幼蟲使其幾種解毒酶活性被逐漸誘導(dǎo)激活，增強水解代謝以達到解毒的目的。隨著藥劑處理時間的延長，幼蟲體內(nèi)的呋喃蟲酰肼含量逐漸增加，解毒酶活性抑制趨勢逐漸增強，最終解毒酶活性逐漸被抑制，從而降低了幼蟲對該藥劑的解毒作用，導(dǎo)致中毒后幼蟲本身的生理機能下降、死亡。

表6 低劑量呋喃蟲酰肼對舞毒蛾發(fā)育指標(biāo)的影響

經(jīng)呋喃蟲酰肼處理后，舞毒蛾幼蟲出現(xiàn)蟲體發(fā)黑、頭殼凸起、無法翻身、身體縮小等中毒癥狀，且在48 h時幾種解毒酶的活性均被抑制，這表明舞毒蛾幼蟲體內(nèi)的解毒作用被中斷。低劑量呋喃蟲酰肼能夠顯著影響舞毒蛾幼蟲的發(fā)育速率和成活率，藥劑連續(xù)處理15～20 d，幼蟲全部死亡，化蛹前幼蟲死亡率已達100%。這說明呋喃蟲酰肼能明顯干擾舞毒蛾的生長發(fā)育，對低齡和老齡的舞毒蛾幼蟲均具有較高的毒殺作用。因此，呋喃蟲酰肼可用作高毒殺蟲劑的替代品［6］，可作為防治舞毒蛾的安全、有效藥劑。

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