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    榆樹皮粗多糖組成及體外抗氧化作用

    2011-08-09 11:08:02楊明非
    關(guān)鍵詞:超氧榆樹內(nèi)標(biāo)

    楊明非

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

    多糖是一類天然大分子化合物,其作為藥物始于1943年。之后數(shù)十年的研究逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能,多糖作為廣譜免疫促進(jìn)劑引起了人們極大的興趣。特別是近十年來人們對(duì)糖的認(rèn)識(shí)有了質(zhì)的飛躍,現(xiàn)確定植物多糖的主要功能有:調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖等作用。因此,對(duì)多糖類的研究再次成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。榆樹皮中就含有大量的黏液質(zhì)(植物多糖)。榆樹(Ulmus pumila L.)在我國自然分布較廣,且耐旱、耐寒、耐瘠薄。榆樹根系發(fā)達(dá),抗風(fēng)保土力強(qiáng),在較干旱的貧瘠荒丘坡地都可較好生長,可謂資源豐富。榆樹皮又稱榆白皮,主要功用有:利水、通淋、消腫等,為常見中藥。已知榆樹皮中的成分有:β-谷甾醇、植物甾醇、豆甾醇、鞣質(zhì)、樹膠及脂肪油等[1]。但是對(duì)榆樹多糖的組成、作用等研究尚未見報(bào)道。本文從榆樹皮中提取榆樹多糖,以確認(rèn)榆樹皮多糖的組成,進(jìn)而研究它的抗氧化活性,為榆樹皮的進(jìn)一步研究、開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試材

    儀器:TU—1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司);Avatar360型傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet);6890N氣相色譜儀(Agilent Technologies)。

    試樣:鮮榆樹皮剪段,低溫脫水并干燥粉碎(含水率41.13%),采用索氏提取法在90℃下用無水乙醇除雜質(zhì),備用。

    試劑:所用試劑均為分析純或生化試劑。

    1.2 多糖提取

    榆樹皮多糖以水提取,方法參照文獻(xiàn)[2]:精稱10 g干樣,料液比1 g∶70 g,80℃水浴回流浸提3 h,冷卻,過濾,Sevage法除蛋白,濃縮至原體積的1/7,加入4倍體積無水乙醇,醇析沉淀,靜置過濾,留濾渣,低溫干燥,制得粗多糖。

    1.3 粗多糖成分分析

    粗多糖紫外可見光譜分析:配制質(zhì)量濃度為6.4 g·L-1粗多糖水溶液。波長掃描范圍:200~800 nm。

    紅外光譜表征:用KBr壓片法測試榆樹粗多糖紅外光譜圖。

    粗多糖組成的氣譜分析參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

    ①粗多糖水解。H2SO4水解法,得水解單糖備用(衍生化略)。

    ②標(biāo)準(zhǔn)糖衍生化。稱取木糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖各約10 mg,分別加入20 mg鹽酸羥胺、20 mL吡啶,振蕩,90℃水浴30 min,取出冷卻后加2.0 mL乙酸酐于90℃水浴中酰化30 min,濃縮至5 mL,冷卻。

    ③肌醇六乙酸酯(內(nèi)標(biāo)物)的制備。用肌醇配制成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的甲醇溶液,制備同②。

    ④色譜試樣準(zhǔn)備。取各標(biāo)準(zhǔn)糖衍生物、粗多糖水解衍生物適量,分別加入內(nèi)標(biāo)物(肌醇六乙酸酯)適量,混勻備用。

    ⑤氣譜條件。氣譜柱型號(hào)PH—5,30 mm×0.25 mm×0.25μm。程序升溫:40℃ 5 min,8℃·min-1升溫至260℃,保持30 min。汽化室溫度250℃,F(xiàn)ID為250℃,載氣為N2,進(jìn)樣量0.5 μL。

    采用標(biāo)準(zhǔn)糖定性內(nèi)標(biāo)法定量,分析榆樹皮多糖組成。

    1.4 粗多糖抗氧化性

    1.4.1 普魯士藍(lán)法比較粗多糖與Vc還原能力

    粗多糖還原能力測定方法參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

    取用不同質(zhì)量濃度的粗多糖溶液及Vc溶液(Vc為對(duì)比物),加入各試劑啟動(dòng)反應(yīng),放置10 min,于700.00 nm處測定其吸光度A。A值越大,樣品的還原能力越強(qiáng)。

    1.4.2 粗多糖與Vc清除羥自由基(Smirnoff法)比較

    粗多糖清除羥自由基試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[5]、[6]進(jìn)行。

    ①分析波長。取用質(zhì)量濃度分別為2.210 g·L-1的粗多糖溶液及0.4050 g·L-1Vc 適量,依次加入5.00 mL 9.0 mmol·L-1FeSO4、5.00 mL 9.5 mmol·L-1水楊酸—乙醇溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊體積至 15.00 mL,搖勻,再加入 8.8 mmol·L-1H2O2溶液5.00 mL啟動(dòng)反應(yīng),搖勻后于37℃條件下反應(yīng)30 min,迅速在紫外—可見分光光度計(jì)上掃描,波長掃描范圍是200.00~800.00 nm。粗多糖溶液及Vc均不引起特征吸收峰位移,確定分析波長為525.00 nm。

    ②羥自由基生成時(shí)間。試驗(yàn)步驟如①,測定反應(yīng)時(shí)間為0~60.0 min時(shí)段的吸光度A525.00nm。反應(yīng)于15 min后趨于穩(wěn)定,時(shí)間確定為15 min。

    ③榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基比較。粗多糖樣品對(duì)羥自由基的清除能力按下式計(jì)算:SA=((A0-(Ai-Ai0))/A0)×100%。式中:A0為總自由基的吸光度;Ai為粗多糖消除自由基后的吸光度;Ai0為粗多糖本底吸光度。

    ①掃描時(shí)間段。從加入鄰苯三酚溶液1 min后計(jì)時(shí),20 s/次,連續(xù)掃描共 20 min,測定 A319.00nm。

    ②粗多糖對(duì)超氧自由基清除作用。取質(zhì)量濃度為1.476 g·L-1粗多糖溶液分別為 0、3、5、8、10、13、15 mL,測定各自氧化速率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 粗多糖光譜分析結(jié)果

    按1.2中的方法提取粗多糖,其提取率為116.3 mg·g-1。用此粗多糖測定紫外可見光譜,見圖1。由圖1可見:粗多糖溶液在260 nm處無核酸吸收;在280 nm處無蛋白吸收。說明粗多糖無核酸、無蛋白干擾,較純。

    圖1 榆樹皮粗多糖水溶液紫外光譜圖

    用KBr壓片法獲得榆樹粗多糖紅外光譜圖(圖2)。圖2中:3 419 cm-1(寬峰)為糖類等O—H伸縮振動(dòng);1 417 cm-1為C—O伸縮振動(dòng);1 326 cm-1為C—H變角振動(dòng),這是由D—葡萄糖、D—甘露醇、D—木糖和半乳糖醛酸組成糖類的特征吸收峰;1 070 cm-1處雙峰為呋喃糖苷的特征吸收;603 cm-1為O—H的外平面振動(dòng)峰。紅外譜圖表明該物質(zhì)是多糖[6-7]。

    2.2 粗多糖組成的氣譜分析

    肌醇衍生化制備肌醇六乙酸酯(內(nèi)標(biāo)物)經(jīng)氣譜分析為單峰,相對(duì)含量大于99.5%,可作內(nèi)標(biāo)物。榆樹皮粗多糖色譜分析表明,粗多糖由6種單糖組成。定性、定量結(jié)果見表1。

    2.3 粗多糖與Vc還原能力的比較

    榆樹粗多糖具有很強(qiáng)的還原能力,且還原能力隨質(zhì)量濃度增加而明顯遞增。榆樹粗多糖質(zhì)量濃度低于0.221 0 g·L-1時(shí),其還原能力比對(duì)照物Vc差;當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度大于0.441 9 g·L-1時(shí),其還原能力要強(qiáng)于同等質(zhì)量濃度的Vc;質(zhì)量濃度在0.6~1.5 g·L-1時(shí),榆樹粗多糖的還原能力比Vc高出50%~70%,還原能力很強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

    圖2 榆樹皮粗多糖紅外光譜圖

    表1 粗多糖水解單糖定性、定量結(jié)果

    表2 榆樹粗多糖與Vc還原能力

    2.4 粗多糖與Vc清除羥自由基的比較

    清除羥自由基的分析波長為525.00 nm。羥自由基生成時(shí)間在反應(yīng)15 min后趨于穩(wěn)定,測試時(shí)間確定為15 min。榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基的比較結(jié)果見表3。

    由表3 可見,Vc 質(zhì)量濃度從0.10 g·L-1增加到0.25 g·L-1時(shí),對(duì)羥自由基的清除率陡然上升,之后趨于平緩。榆樹粗多糖質(zhì)量濃度從0.2~0.52 g·L-1是穩(wěn)步上升的,但是對(duì)羥自由基的清除率遠(yuǎn)不如Vc。

    2.5 粗多糖清除超氧自由基(O-2·)

    采用鄰苯三酚自氧化法測定粗多糖清除超氧自由基(O-2·),其中間產(chǎn)物的積累在滯后30~45 s時(shí)與時(shí)間呈良好的線性關(guān)系,該有色產(chǎn)物在319 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收,見圖3。

    清除超氧自由基的反應(yīng)在0~5 min時(shí)可近似表示為一元線性方程(y=0.115 5x+0.164 1;相關(guān)系數(shù) R2=0.994 2),確認(rèn)掃描時(shí)間段為0~5 min。

    不同體積下粗多糖對(duì)超氧自由基清除作用的各自氧化速率(各自氧化曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99)見表4。

    表3 榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基比較

    圖3 榆樹皮粗多糖清除超氧自由基分析波長

    3 結(jié)論

    榆樹皮中含有較多的多糖。以水提取獲得的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為116.3 mg·g-1。氣譜標(biāo)準(zhǔn)物定性表明,粗多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和甘露醇組成,定量分析結(jié)果分別為:168.7、182.2、120.1、66.0、221.6、141.8 mg·g-1,回收率達(dá)90.04%。其中的甘露糖或許與榆樹皮具有利水、通淋等功能相關(guān)聯(lián)。

    表4 榆樹皮粗多糖清除超氧自由基

    榆樹皮粗多糖還原能力比還原能力很強(qiáng)的陽性對(duì)照物Vc高出50%~70%。當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度大于0.211 0 g·L-1時(shí),對(duì)羥自由基有明顯的清除能力,最大清除率為59.67%,但遠(yuǎn)不如對(duì)照物Vc。

    榆樹粗多糖具有很強(qiáng)的還原能力,對(duì)羥自由基和超氧自由基在一定程度上有抑制和清除作用,有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發(fā)應(yīng)用。

    [1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典:下冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1994:2438.

    [2]胡仲秋,王利,王保玲,等.枸杞多糖提取及消除羥自由基活性研究[J].食品科學(xué),2009,30(24):93-98.

    [3]朱彩平,張聲華.枸杞多糖的提取及其組成的氣相色譜分析[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(11):1327-1328.

    [4]于文廣,王郝,白瑩,等.四種藥用植物花總黃酮類物質(zhì)提取及抗氧化性研究[J].中國野生植物資源,2010,29(2):44-47.

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    [7]程超,李偉,汪興平.平菇水溶性多糖結(jié)構(gòu)表征與體外抗氧化作用[J].食品科學(xué),2005,26(8):55-57.

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