氯吡脲殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及趨勢(shì)

雷紹榮，郭靈安，毛建霏，歐陽華學(xué)，代曉航

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066）

0 引 言

氯吡脲是一種較新的人工合成高效植物生長調(diào)節(jié)劑，屬于苯脲類細(xì)胞分裂素，又稱為吡效隆、調(diào)吡脲、膨果龍、吡效隆醇、施特優(yōu)等，英文通用名forchlorfenuron，英文別名fulmet、CPPU、KT-30、4PU-30等。氯吡脲化學(xué)名稱1-（2-氯-4-吡啶）-3-苯基脲，CAS號(hào)：68157-60-8，結(jié)構(gòu)式如下：

其生理作用主要有：（1）促進(jìn)細(xì)胞分裂，擴(kuò)大細(xì)胞體積；（2）促進(jìn)坐果、果實(shí)膨大；（3）調(diào)節(jié)植物花青苷的產(chǎn)生；（4）誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，產(chǎn)生無籽水果等。由于其生長促進(jìn)作用效果優(yōu)異，尤其是促進(jìn)果實(shí)膨大，因而被廣泛應(yīng)用于獼猴桃、葡萄、蘋果、黃瓜、煙草、水稻、大豆等多種作物上[1]。對(duì)于氯吡脲，當(dāng)前不同國家針對(duì)不同作物制定的MRL不同，范圍為10～100μg/kg[2]。如對(duì)于獼猴桃中氯吡脲的最大殘留水平澳大利亞為10 μg/kg，美國為 40 μg/kg，中國和歐盟為 50μg/kg，日本為100 μg/kg，為保證食品安全，滿足國際市場(chǎng)的要求，需要采用靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來對(duì)氯吡脲殘留進(jìn)行定量檢測(cè)。目前國內(nèi)外報(bào)道的絕大多數(shù)為反相液相色譜法，檢測(cè)器則主要采用紫外檢測(cè)器和串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器使用方便，成本較低，易于廣泛推廣，經(jīng)過前處理的優(yōu)化能夠達(dá)到目前最嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但紫外檢測(cè)器在定性方面則有所不足；質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，定性更為嚴(yán)格準(zhǔn)確，但是使用較復(fù)雜且成本較高。該文對(duì)當(dāng)前國內(nèi)外的氯吡脲檢測(cè)方法進(jìn)行了全面的總結(jié)，簡(jiǎn)要分析了各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并分析了其發(fā)展趨勢(shì)。

1 液相色譜-紫外檢測(cè)法

液相色譜-紫外檢測(cè)法使用簡(jiǎn)便且成本較低，易于普遍推廣。由于氯吡脲在260～265nm紫外吸收強(qiáng)，液相色譜-紫外檢測(cè)方法結(jié)合合適的前處理步驟，能夠達(dá)到國際上的最低MRL10μg/kg的檢測(cè)要求。

1.1 液液萃取

Sharma等使用液液萃取，高效液相色譜-紫外法測(cè)定了葡萄、土壤和水中的吡效隆殘留[3]。液液萃取樣品前處理步驟較為繁瑣，不適合常規(guī)大批量檢測(cè)。

1.2 SPE固相萃取

胡繼業(yè)等首次采用固相萃取高效液相色譜-紫外法測(cè)定了西瓜中的氯吡脲殘留，使用乙腈提取，PSA固相萃取小柱凈化，去除干擾峰的同時(shí)保持了氯吡脲良好的回收率。

后來，胡繼業(yè)等沿用該方法建立了氯吡脲在土壤和西瓜中殘留的HPLC分析方法。最小檢出濃度為5 μg/kg，檢測(cè)限為0.4ng。其對(duì)西瓜消解動(dòng)態(tài)的研究表明,氯吡脲在西瓜中半衰期為1.20～1.67d，并推薦我國MRL取10 μg/kg[4]。Kobayashi等采用丙酮萃取，過濾濃縮后經(jīng)過兩次固相萃取凈化，高效液相色譜紫外檢測(cè)，檢出限0.005 mg/kg，但提取非常煩瑣、耗時(shí)。Kobayashi等用該方法對(duì)日本國內(nèi)生產(chǎn)的19類蔬菜和水果進(jìn)行了檢測(cè)，均未檢出[5]。Zhang等使用乙酸乙酯提取，ENVI-18小柱固相萃取凈化，HPLC-UV測(cè)定了獼猴桃、葡萄、番茄和黃瓜中的氯吡脲的殘留，流動(dòng)相甲醇/水 65∶35（v/v），檢測(cè)波長 260 nm，線性范圍 0.1～10.0 μg/mL，檢出限0.02mg/kg[6]。SPE固相萃取減小了所需溶劑用量，相對(duì)液液萃取提高了處理通量，并提高了方法的穩(wěn)定性。

1.3 DSPE分散固相萃取

胡江濤等針對(duì)獼猴桃，建立了分散固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)氯吡脲的方法。試樣經(jīng)乙腈提取，PSA分散固相萃取（DSPE）凈化后用反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為：流動(dòng)相乙腈/磷酸水溶液（0.01mol/L）=35/65（v/v），檢測(cè)波長 260 nm。檢出限0.005mk/kg，線性范圍0.05～10.0mg/L內(nèi)線性良好。提取步驟為：獼猴桃鮮樣經(jīng)勻漿后，稱取5g試樣置于50mL具塞離心管中，加入5.0mL乙腈，渦旋振蕩2 min，超聲提取20 min后，加入2 g無水MgSO4和 0.5 g NaCl，渦旋振蕩2 min，以 8 000 r/min離心10 min。凈化步驟：取提取液1.00mL于2mL Teflon離心管中，加入100mg PSA和100mg無水MgSO4，渦旋1 min，以3 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶中，供液相色譜測(cè)定[7]。分散固相萃取方便快速，靈敏度高，可用于批量樣品的快速處理。

1.4 其 他

徐德峰等在國內(nèi)較早用高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法對(duì)氯吡脲進(jìn)行了測(cè)定，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長254 nm，流動(dòng)相甲醇/水（pH 3.0）=55/45（v/v），內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸二甲酯，但未進(jìn)行實(shí)際樣品殘留檢測(cè)[8]。高立明等采用液相色譜法測(cè)定氯吡脲含量。采用C18色譜柱，以對(duì)羥基苯甲酸丙酯為內(nèi)標(biāo)，以甲醇+純水（60+40）（ν/ν）做為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為 260nm，未對(duì)實(shí)際樣品殘留進(jìn)行檢測(cè)[9]。汪偉對(duì)包括氯吡脲在內(nèi)的6種常見的植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了高效液相色譜檢測(cè)，但未進(jìn)行實(shí)際樣品殘留檢測(cè)，對(duì)于實(shí)際樣品氯吡脲殘留檢測(cè)需要進(jìn)一步摸索提取及凈化步驟[10]。

李瑞娟等采用酸化二氯甲烷提取，蒸干后甲醇定容，使用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器定量分析氯吡脲在獼猴桃和土中的消解動(dòng)態(tài)與最終殘留。氯吡脲在獼猴桃和土中的最低檢測(cè)濃度為0.01 mg/kg，在獼猴桃中的半衰期為4.8～8.4 d，在土壤中的半衰期為8.8～12.7d[11]。李佳等使用酸化丙酮提取黃瓜，酸化甲醇提取土壤樣品，蒸干后甲醇定容，建立了氯吡脲在土壤和黃瓜中殘留的HPLC分析方法，最小檢出濃度為 3.75×10-3mg/kg，檢測(cè)限為 3.0×10-10g。氯吡脲在黃瓜中半衰期為5.50～7.61 d，在土壤樣品中的半衰期為6.54～8.39 d，李佳等建議采用10 μg/kg為MRL值[12]。不進(jìn)行凈化直接測(cè)定，可以簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，但是需要小心考察基質(zhì)的干擾并加強(qiáng)對(duì)儀器的維護(hù)。

Liu等使用酸化甲醇提取，濃縮后用活性炭凈化，大體積甲醇洗脫，再次干燥定容，HPLC-UV測(cè)定。Liu等使用該法測(cè)定了黃瓜和紅土中的氯吡脲的殘留，測(cè)得氯吡脲在黃瓜和土壤中的半衰期為5～9d[13]。由于氯吡脲有2個(gè)芳香環(huán)，與炭黑相互作用力強(qiáng)，不容易洗脫，對(duì)該方法的穩(wěn)定性和回收率會(huì)造成影響。

2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，包括三重四級(jí)桿和離子阱質(zhì)譜，是目前水果和蔬菜中農(nóng)殘分析最有效的技術(shù)之一。其具有良好的靈敏度和選擇性，因此降低了對(duì)樣品前處理去除基質(zhì)的要求，但是需要考慮基質(zhì)效應(yīng)，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道一些液質(zhì)聯(lián)用方法可以忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響，但通常都采用基質(zhì)匹配標(biāo)液來定量。同時(shí)，由于分析儀器的發(fā)展，在簡(jiǎn)化前處理步驟的同時(shí)，對(duì)于氯吡脲單殘留檢測(cè)逐漸向把氯吡脲包括在例行多殘留檢測(cè)中。

2.1 氯吡脲液相色譜-質(zhì)譜單殘留檢測(cè)

Valverde等使用緩沖鹽QuEChERS方法萃取凈化，LC/TQ-MS測(cè)定了西瓜中氯吡脲殘留1～200μg/kg范圍線性良好，檢出限1μg/kg。后又使用LC/TOFMS測(cè)定了西瓜、番茄和南瓜中的氯吡脲，10～500μg/kg范圍線性良好，將10 μg/kg水平作為方法定量下限（LOQ），信噪比和回收率都滿足實(shí)際應(yīng)用需要[2]。

2.2 氯吡脲和其他多殘留同時(shí)檢測(cè)

色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用使得多殘留檢測(cè)更加準(zhǔn)確方便，可同時(shí)測(cè)定多種類別不同物理化學(xué)性質(zhì)的農(nóng)藥殘留，并且不一定需要色譜基線分離。這樣就簡(jiǎn)化了樣品的前處理，而盡可能多的去除雜質(zhì)干擾，達(dá)到基線分離是傳統(tǒng)色譜分析方法所必須的。然而，色譜質(zhì)譜聯(lián)用必須考慮樣品的基質(zhì)效應(yīng)，在液譜中主要為對(duì)目標(biāo)分子離子化效率的影響。因此通常串聯(lián)質(zhì)譜都需要用基質(zhì)匹配標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要使用合適的空白樣品，有時(shí)還需要使用同位素內(nèi)標(biāo)，帶來一定的不便。近年來，液相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定包括氯吡脲在內(nèi)的多種殘留的報(bào)告逐漸增多，樣品種類不斷增加并且逐漸成為以后的發(fā)展趨勢(shì)，前處理則基于Anastassiades等發(fā)展的QuEChERS方法的文獻(xiàn)逐漸增多。

Anastassiades等在發(fā)展QuEChERS方法時(shí)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯同樣能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)農(nóng)殘獲得較好的回收率，并且雜質(zhì)較少。后由于一些pH敏感的分子用乙腈提取效果更好，最終選擇了乙腈作為提取溶劑。由于乙酸乙酯萃取雜質(zhì)較少，尤其是含糖量較高的樣品，因此也有文獻(xiàn)報(bào)道選擇乙酸乙酯進(jìn)行萃取，并取得良好檢測(cè)能力。如Banerjee等采用乙酸乙酯萃取的PSA分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，測(cè)定了葡萄中的82種和芒果中的87種農(nóng)藥殘留，并對(duì)不確定度進(jìn)行了評(píng)估，葡萄中多種殘留定量下限均不大于10μg/kg，其中氯吡脲定量下限1.0μg/kg，檢出限0.3μg/kg。芒果中殘留定量下限均小于10μg/kg，其中氯吡脲定量下限2.5μg/kg，檢出限1μg/kg[14]。

Wang等使用QuEChERS方法提取凈化，UPLCESI-Q-TOF和LC-MS/MS測(cè)定了水果和蔬菜中的138種，草莓中148種，蘋果中90種，嬰幼兒蔬果食物中142種農(nóng)藥殘留。對(duì)于氯吡脲，均能滿足10μg/kg的要求[15-18]。

丁慧瑛等建立了同時(shí)測(cè)定蔬菜中氯吡脲和另外10種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。試樣經(jīng)乙腈提取,PSA和C18填料分散固相萃取凈化，C18柱反相液相色譜分離，以甲醇和0.005 mol/L醋酸銨溶液混合為流動(dòng)相梯度洗脫，電噴霧負(fù)離子模式離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式監(jiān)測(cè)，三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定。結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、靈敏度高，檢出限為3 μg/kg，定量下限為 10 μg/kg[19]。

Camino-Sanchez等使用QuEChERS方法提取凈化，LC-MS/MS測(cè)定了水果和蔬菜中包括氯吡脲的69種殘留進(jìn)行了檢測(cè)，成功對(duì)西班牙Almeria省溫室培養(yǎng)的2000多份蔬菜樣品進(jìn)行了例行檢測(cè)[20]。

Wong等聯(lián)合3家實(shí)驗(yàn)室比對(duì)使用QuEChERS方法提取凈化，LC-MS/MS測(cè)定了水果和蔬菜中包括氯吡脲的191種殘留。對(duì)于氯吡脲，比對(duì)結(jié)果顯示外標(biāo)法比內(nèi)標(biāo)法偏高，內(nèi)標(biāo)法更為準(zhǔn)確[21]。

3 其他檢測(cè)方法

姜欣，雷紹榮等早在20世紀(jì)90年代就使用氣相色譜法對(duì)氯吡脲進(jìn)行了測(cè)定，但未對(duì)實(shí)際樣品殘留進(jìn)行檢測(cè)[22-23]。Suarez-Pantaleon等發(fā)展了免疫法測(cè)定氯吡脲檢出限可達(dá)（12.42±3.06）ng/L，并對(duì)實(shí)際獼猴桃中的殘留進(jìn)行了檢測(cè)，取得良好的結(jié)果，但該方法目前尚難以得到推廣[24-25]。

4 結(jié)束語

目前來看，國內(nèi)外的氯吡脲檢測(cè)方法絕大多數(shù)為反相液相色譜-紫外/質(zhì)譜檢測(cè)。紫外檢測(cè)成本更低，更易于推廣。但是對(duì)于痕量檢測(cè)，紫外檢測(cè)器的定性能力不足，可靠性不如質(zhì)譜檢測(cè)器，必須消除基質(zhì)的干擾。液質(zhì)聯(lián)用定性準(zhǔn)確，靈敏度好，但設(shè)備昂貴。同時(shí)必須考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)分子離子化效率的影響。近年來興起的超高效液相色譜能夠加快樣品檢測(cè)速度，提高樣品分離度，但是超高效液相色譜柱相對(duì)普通液相色譜柱更加昂貴且抗污染能力減弱。

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于吡效隆的檢測(cè)，未來的趨勢(shì)主要是前處理的簡(jiǎn)化和液相色譜-質(zhì)譜多殘留同時(shí)檢測(cè)。隨著液相色譜-質(zhì)譜的發(fā)展，從最初的液液萃取，向固相小柱萃取，再向分散固相萃取發(fā)展，其中基于QuEChERS的提取凈化方法已經(jīng)成為主流。其消耗的有機(jī)試劑減少、時(shí)間縮短，處理通量提高。檢測(cè)也從專門的氯吡脲殘留檢測(cè)向例行多殘留同時(shí)檢測(cè)發(fā)展。同時(shí)檢測(cè)樣品范圍也不斷擴(kuò)大，靈敏度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)不斷提高。

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