非病毒誘導(dǎo)體系高效誘導(dǎo)臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化

李 晶,朱 莉,趙春華

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所組織工程研究中心,北京 100005

國內(nèi)外研究已經(jīng)使用胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞在一定條件下體外誘導(dǎo)分化成為胰島素分泌細(xì)胞,且獲得的細(xì)胞具有一定體內(nèi)外分泌功能[1-3],該類研究為細(xì)胞替代移植治療糖尿病提供了思路,但細(xì)胞來源少,細(xì)胞成瘤性及倫理限制等問題限制了其向臨床轉(zhuǎn)化。本課題組以往研究表明,骨髓、脂肪及臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell,MSC)具有亞全能干細(xì)胞[4]的特征,其能向多胚層分化且具有低免疫原性的特征[5],同時(shí)該種細(xì)胞來源廣泛并且不受倫理學(xué)限制,有望成為臨床細(xì)胞移植的良好種子細(xì)胞。本研究將采用可用于臨床的非病毒誘導(dǎo)體系探討使用UC-MSC獲得胰島細(xì)胞的方法,并研究誘導(dǎo)后細(xì)胞是否具有與胰島相似的功能,從而為細(xì)胞移植治療糖尿病提供依據(jù)。

材料和方法

試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,DMEM/F-12、胎牛血清、青鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司,維甲酸、exendin-4、尼克酰胺、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子 (epidermal growth factor,EGF)均購自美國Sigma公司,Activin A購自英國Pepro Tech公司,Trizol購自美國 Invitrogen公司,Oligo dT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制劑購自日本Takara公司,小鼠抗人胰島素單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,兔抗人 C-肽多克隆抗體購自英國ABcam公司,羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。

UC-MSC的分離、培養(yǎng)、表型鑒定及分化潛能 UC-MSC取自北京協(xié)和醫(yī)院剖腹產(chǎn)足月胎兒臍帶,將臍帶剪成1 cm后鈍性分離臍動(dòng)脈和臍靜脈,將華通氏膠剪碎后采用0.1%的膠原酶消化,過濾離心后重懸計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d全量更換培養(yǎng)基。表型鑒定及分化潛能鑒定參考文獻(xiàn) [6]。

UC-MSC向胰島細(xì)胞誘導(dǎo)分化 采用第3代UCMSC作為誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞,第1階段使用含Activin A的低血清高糖DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞,第2階段更換含高濃度維甲酸、bFGF、EGF的無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基,第3階段改用含exendin-4、尼克酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基至誘導(dǎo)結(jié)束,于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)每階段末取樣檢測(cè)mRNA及蛋白表達(dá)變化。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用Trizol法提取總RNA,取2μg總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA;RT-PCR法檢測(cè)不同階段末期 foxa2、sox17、pdx1、ngn3、pax4、insulin和glut-2的mRNA表達(dá)變化,所有引物由美國Invitrogen公司合成。

免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè) 細(xì)胞分別于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)每階段末以80%冰乙醇固定,0.5%Triton X-100透化處理,分別使用1∶50小鼠抗人胰島素單克隆抗體和1∶100兔抗人 C-肽多克隆抗體4℃過夜反應(yīng),洗滌后使用1∶50羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔抗體室溫避光作用1 h,沖洗后甘油封片。細(xì)胞核染色用1∶10000 Hoechst 33342室溫作用1 min。采用 Olympus熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

細(xì)胞胰島素總量測(cè)定 收集未誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清及誘導(dǎo)第3階段末細(xì)胞培養(yǎng)上清,400 g離心10 min,留取上清保存于-80℃冰箱中備用,使用胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒行樣品胰島素測(cè)定,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

細(xì)胞C-肽分泌功能測(cè)定 誘導(dǎo)第3階段末細(xì)胞,采用PBS洗滌3遍后置于無糖KRBH緩沖液孵育3～6 h,后于含5.5 mmol/L葡萄糖KRBH緩沖液中孵育1 h,收集孵育緩沖液,再于22 mmol/L葡萄糖KRBH緩沖液中孵育1 h,收集孵育緩沖液。使用C-肽ELISA試劑盒測(cè)定 C-肽濃度,具體測(cè)定方法參考試劑盒說明書。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

UC-MSC誘導(dǎo)分化為成熟胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 選擇第3代UC-MSC作為誘導(dǎo)種子細(xì)胞,未誘導(dǎo)的UC-MSC呈梭形貼壁生長,誘導(dǎo)第1階段末觀察細(xì)胞,90%以上細(xì)胞呈卵石樣,誘導(dǎo)第2階段末細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán),誘導(dǎo)第3階段末可見明顯成團(tuán)聚集的類胰島結(jié)構(gòu) (圖1)。

UC-MSC誘導(dǎo)分化為成熟胰島細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 為觀察UC-MSC在非病毒體外誘導(dǎo)條件下向胰島細(xì)胞方向分化過程,誘導(dǎo)第1階段末檢測(cè)了限定性內(nèi)胚層 (definitive endoderm,DE)相關(guān)基因foxa2和sox17的表達(dá),結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后細(xì)胞foxa2和sox17的表達(dá)均明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞 (P均 ＜0.05)。誘導(dǎo)第2階段末,誘導(dǎo)細(xì)胞胰腺干、祖細(xì)胞相關(guān)基因pdx1、ngn3和pax4的表達(dá)均明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞 (P均 ＜0.05)。誘導(dǎo)第3階段末,誘導(dǎo)細(xì)胞的成熟胰島細(xì)胞標(biāo)志insulin和glut-2的表達(dá)均明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞 (P均 ＜0.05)。

誘導(dǎo)分化成熟胰島細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示,誘導(dǎo)前UC-MSC不表達(dá)胰島素和C-肽,誘導(dǎo)第3階段末細(xì)胞大量表達(dá)胰島素及C肽,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野的細(xì)胞判斷其誘導(dǎo)為胰島細(xì)胞的效率可達(dá)90%以上 (圖2)。

誘導(dǎo)分化后細(xì)胞胰島素及C-肽分泌功能測(cè)定為了檢測(cè)誘導(dǎo)第3階段末細(xì)胞是否具有胰島素分泌功能,采用胰島素測(cè)定及 C-肽釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)第3階段末細(xì)胞胰島素總量為 (346.3739±32.5149)μ U/ml,明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞的 (17.69±1.46)μ U/ml(P ＜0.01)。葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,誘導(dǎo)置于5.5 mmol/L葡萄糖環(huán)境檢測(cè)基礎(chǔ)C-肽釋放水平為(195.10±8.88)pmol/L/h(P ＜0.01),細(xì)胞置于22 mmol/L葡萄糖環(huán)境的C-肽釋放水平為 (340.99±7.91)pmol/L/h(P ＜0.01)。

圖1 各階段細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 (×100)Fig 1 Morphology change of cells at all stages(×100)

圖2 胰島素和C-肽免疫細(xì)胞熒光結(jié)果,細(xì)胞核 (藍(lán)色)使用hochest33342染色,胰島素 (紅色)為胞漿染色 (×100)Fig 2 Results of immunofluorescence staining of insulin and c-peptide in induced cells and non-induced cells.[cell nuclear staining(blue)with hochest33342 and insulin staining(red)in the cytoplasm](×100)

討 論

2000年開始,各國研究團(tuán)隊(duì)開始研究如何使用鼠或人的胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,通過相關(guān)特異性基因?qū)隱7],添加誘導(dǎo)細(xì)胞因子[8]或小分子化合物[9]等方法誘導(dǎo)分化具有一定胰島素分泌功能的細(xì)胞。也有研究者采用肝臟卵圓細(xì)胞、胰導(dǎo)管細(xì)胞等作為種子細(xì)胞,這些細(xì)胞被認(rèn)為可能是器官內(nèi)存在的干細(xì)胞。近年有人采用糖尿患者的骨髓MSC[10],或者使用脂肪來源的MSC作為胰島素分泌細(xì)胞的種子細(xì)胞,誘導(dǎo)出具有一定功能的胰島素分泌細(xì)胞。本研究則選擇了來源更為廣泛方便且不受倫理限制的UC-MSC,通過貼壁特性,表面標(biāo)志鑒定及成脂、成骨分化潛能確定了細(xì)胞為本課題組以前提出的flk-1+“亞全能干細(xì)胞”[4],具有該特征的細(xì)胞能夠在體內(nèi)外分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等三胚層多種組織細(xì)胞,因此,本研究將其作為種子細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)胚層來源的胰島細(xì)胞誘導(dǎo),通過形態(tài)學(xué)觀察、基因表達(dá)水平、蛋白水平及分泌功能的評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)能夠成功獲得有功能的胰島素分泌細(xì)胞。

胚胎發(fā)育中,受精卵分化形成胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán),內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育成原條,然后進(jìn)一步分化成中內(nèi)胚層及外胚層,中內(nèi)胚層又可分化成中胚層及DE,DE隨后發(fā)育成胰腺內(nèi)胚層,胰腺內(nèi)胚層可發(fā)育成胰腺的相關(guān)結(jié)構(gòu),包括:胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺外分泌細(xì)胞及胰腺導(dǎo)管細(xì)胞[11-12]。本研究在胰腺胚胎發(fā)育過程研究的基礎(chǔ)上,參考了以往誘導(dǎo)方案中的優(yōu)勢(shì),以每個(gè)發(fā)育分化階段特異性轉(zhuǎn)錄因子為標(biāo)志,建立了適用于UC-MSC的非病毒分階段體外誘導(dǎo)體系。低血清環(huán)境中Activin A參與誘導(dǎo)產(chǎn)生sox17+DE細(xì)胞,Activin A被認(rèn)為能夠激活activin/nodal信號(hào)通路,該通路在胚胎干細(xì)胞干性保持及DE特化中發(fā)揮重要作用。隨后使用高濃度維甲酸,無血清培養(yǎng)基特化DE細(xì)胞成為pdx1+的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞,添加的高濃度維甲酸能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)pdx1的表達(dá)[13],bFGF則可促使細(xì)胞分裂增殖,有利于獲得更多pdx1+細(xì)胞。最后,采用有利于胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子exendin-4聯(lián)合尼克酰胺促進(jìn)胰島細(xì)胞進(jìn)一步分化及成熟,獲得的細(xì)胞表達(dá)胰島素及C-肽并對(duì)葡萄糖刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。

在對(duì)胰腺發(fā)育及胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化分析中得知:DE的特化可看作是形成胰腺組織包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的第1步。本研究中使用的UC-MSC通常被認(rèn)為處于早期中胚層階段且細(xì)胞為一不均一群體,這群細(xì)胞經(jīng)過第1階段誘導(dǎo)后DE相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào),同時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出與內(nèi)胚層細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)的相似性[14],說明UC-MSC可能處于一個(gè)比通常認(rèn)為的早期中胚層細(xì)胞更早的階段,或者這一不完全均一的細(xì)胞群中含有比早期中胚層細(xì)胞早的細(xì)胞亞群,該細(xì)胞可能在誘導(dǎo)分子作用下經(jīng)過了間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化后形成DE細(xì)胞群,這群細(xì)胞為進(jìn)一步獲得胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞及成熟的胰島細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

此外,獲得的成熟胰島細(xì)胞幾乎90%以上均表達(dá)C-肽及胰島素,胰島素及C-肽檢測(cè)則進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞的功能性,與之前研究相比,本研究使用了更易獲得的細(xì)胞來源并且更為高效的獲得目的細(xì)胞,其體內(nèi)功能將在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。本研究擴(kuò)展了成體干細(xì)胞體外非病毒聯(lián)合誘導(dǎo)的思路并為臨床移植替代治療糖尿病帶來希望。

[1]Soria B,Roche E,Bern á G,et al.Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Diabetes,2000,49(2):157-162.

[2]D'Amour KA,Bang AG,Eliazer S,et al.Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells[J].Nat Biotechnol,2006,24(11):1392-1401.

[3]Zhu FF,Zhang PB,Zhang DH,etal.Generation ofpancreatic insulin-producing cells from rhesus monkey induced pluripotent stem cells[J].Diabetologia,2011,54(9):2325-2336.

[4]Fang BJ,Shi M,Liao L,et al.Multiorgan engraftment and multilineage differentiation by human fetal bone marrow Flk1+CD31-CD34-progenitors[J].J Hematother Stem Cell Res,2003,12(6):603-613.

[5]Guo M,Sun Z,Sun QY,et al.A modified haploidentical nonmyeloablative transplantation without T cell depletion for high-risk acute leukemia:successful engraftment and mild GVHD[J].Biol Blood Marrow Transplant,2009,15(8):930-937.

[6]Fang B,Liao L,Shi M,etal.Multipotency of Flk1+CD34-progenitors derived from human fetal bone marrow[J].J Lab Clin Med,2004,143(4):230-240.

[7]Blyszczuk P,Czyz J,Kania G,et al.Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(3):998-1003.

[8]Kroon E,Martinson LA,Kadoya K,et al.Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generate glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo[J].Nat Biotechnol,2008,26(4):443-452.

[9]Chen S,Borowiak M,Fox JL,et al.A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage[J].Nat Chem Biol,2009,5(4):258-265.

[10]Sun Y,Chen L,Hou XG,et al.Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients into insulin-producing cells in vitro[J].Chin Med J(Engl),2007,120(9):771-776.

[11]Roelandt P,Pauwelyn KA,Sancho-Bru P,et al.Human embryonic and rat adult stem cells with primitive endodermlike phenotype can be fated to definitive endoderm,and finally hepatocyte-like cells[J].PLoS One,2010,5(8):e12101.

[12]Tam PP,Loebel DA.Gene function in mouse embryogenesis:get set for gastrulation [J],Nat Rev Genet,2007,8(5):368-381.

[13]Micallef SJ,Janes ME,Knezevic K,et al.Retinoic acid induces Pdx1-positive endoderm in differentiating mouse embryonic stem cells[J].Diabetes,2005,54(2):301-305.

[14]Tada S,Era T,Furusawa C,et al.Characterization of mesendoderm:a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in embryonic stem cell differentiation culture[J].Development,2005,132(19):4363-4374.