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    亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達(dá)的影響

    2011-12-01 06:49:02許彩民
    關(guān)鍵詞:蛋白酶體結(jié)果顯示酸鈉

    羅 慧,楊 洋,許彩民

    中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100005

    ·論著·

    亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞中β-catenin及下游靶基因cyclinD1表達(dá)的影響

    羅 慧,楊 洋,許彩民

    中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100005

    目的研究亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達(dá)的影響。方法采用10μmol/L亞硒酸鈉處理HCT 116和SW480細(xì)胞, Western blot及RT-PCR檢測亞硒酸鈉處理后不同時間HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá)情況,并觀察蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理后對HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1表達(dá)的影響。采用免疫共沉淀方法檢測亞硒酸鈉對HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin與T細(xì)胞因子4(TCF4)相互作用的影響。結(jié)果亞硒酸鈉可降低HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá)水平,用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理可增加亞硒酸鈉處理后HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá)水平。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示,亞硒酸鈉能破壞β-catenin與TCF4間的相互作用。結(jié)論亞硒酸鈉可降低結(jié)直腸癌HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin及cyclin D1的表達(dá)水平,蛋白酶體介導(dǎo)的降解途徑可能在這一過程中發(fā)揮了重要作用。亞硒酸鈉引起的β-catenin與TCF4相互作用減少可能對β-catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄也起到了一定的調(diào)控作用。

    亞硒酸鈉;結(jié)直腸癌;β-catenin; cyclin D1

    結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一,開發(fā)新的治療結(jié)直腸癌化療藥物的研究具有重要意義,能夠與已有的手術(shù)切除、放射治療等方法結(jié)合起來提高結(jié)腸癌的治愈率[1-2]。近來研究表明,硒化合物具有化療和化學(xué)預(yù)防的作用,大量流行病學(xué)和部分臨床資料也支持這一結(jié)論[3]。但是硒化合物的抗癌機(jī)制,尤其是特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制目前尚不清楚。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn),超營養(yǎng)劑量的硒能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,體內(nèi)實驗也表明,亞硒酸鈉能夠抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長,誘導(dǎo)發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡[4]。β-catenin在大部分結(jié)直癌細(xì)胞中都是異常激活的,過度激活的β-catenin能夠促進(jìn)其靶基因的表達(dá),主要涉及一些促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行和抗凋亡基因,如:cyclin D1、survivin等,這些效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和降低細(xì)胞凋亡發(fā)生的敏感性,最后為細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生進(jìn)行提供必要的條件[5-6]。而這些蛋白很多都可以成為治療多種惡性腫瘤的分子靶標(biāo)。本研究觀察了亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達(dá)的影響。

    材料和方法

    材料人來源的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT 116和SW480細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,亞硒酸鈉(純度98%)購自美國Sigma-Aldrich公司,鼠抗人β-catenin抗體、兔抗人T細(xì)胞因子4(T cell factor 4,TCF4)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,MG132購自美國Calbiochem公司。

    細(xì)胞培養(yǎng)將HCT 116、SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(天津灝洋生物公司)、0.2%碳酸氫鈉、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中,孵箱溫度37℃, CO2含量5%。

    Westernblot檢測收集1×107個細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗兩次,RIPA裂解液[20 mmol/L Tris(pH7.5)+150 mmol/L氯化鈉+1 mmol/L EDTA+1 mmol/L EGTA+1% Triton X-100+2.5 mmol/L焦磷酸鈉+1 mmol/L 甘油磷酸+1 mmol/L原釩酸鈉+1 μg/ml亮肽素+1 mmol/L PMSF]裂解細(xì)胞,超聲5 s,每個樣品10次,離心收集上清液即為總蛋白溶液。用Bradford法測量蛋白含量,取等量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,以含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h,兔抗人TCF4抗體(1∶1000)、鼠抗人β-catenin抗體(1∶2000)孵育4℃過夜。TBST洗膜,用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h,TBST洗膜后ECL顯色發(fā)光檢測相應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參照。所有實驗至少重復(fù)3次。

    RT-PCR采用Trizol Reagents (美國Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA。取2 μg RNA用M-MLV、Oligo dT (美國Promega公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系包括β-catenin、cyclin D1、GAPDH的正向引物和反向引物各2 μl,反應(yīng)緩沖液7.8 μl。反應(yīng)條件:94℃ 10 min,94℃ 30 s,54℃ 20 s,72℃ 40 s,30個循環(huán)。所有PCR引物由上海生工公司合成,序列為:(1)β-catenin: 5’-ATTTGATGGAGTTGGACATGGC-3’(正向),5’-CCAGCTACTTGTTCTTGA- GTGAAGG-3’(反向);(2)cyclin D1: 5’-TCTAAGATGAAGGAGACCATC-3’,5’-GCGGTAGTAGGACAGGAAGTTGTT-3’(反向);(3) GAPDH:5’-CAACA- GCCTCAAGATCATCAGC-3’(正向),5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’(反向)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。所有實驗至少重復(fù)3次。

    免疫共沉淀約6×105個細(xì)胞經(jīng)過PBS溶液或硒處理24 h后,收集細(xì)胞,RIPA裂解液冰上裂解30 min,12 000 r/min(r=8.5 cm)離心收集蛋白上清;Bradford法對蛋白定量后,調(diào)蛋白濃度成一致;用相應(yīng)一抗免疫沉淀目的蛋白,4℃,旋轉(zhuǎn)過夜;然后用25 μl瓊脂糖珠子捕獲免疫沉淀復(fù)合物,4℃反應(yīng)3 h;RIPA洗滌沉淀復(fù)合物3遍,3×SDS loading buffer重懸沉淀,煮沸后使蛋白變性;離心收集樣品上清,-80℃保存或進(jìn)一步用Western blot檢測。

    結(jié) 果

    亞硒酸鈉對HCT116和SW480細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響采用10 μmol/L亞硒酸鈉處理HCT 116和SW480細(xì)胞,分別在處理后0、6、12、24 h提取細(xì)胞RNA或總蛋白,RT-PCR檢測結(jié)果顯示,隨著處理時間延長,HCT 116細(xì)胞中的β-catenin mRNA表達(dá)水平下降,而SW480細(xì)胞中沒有明顯變化;Western blot檢測結(jié)果顯示,隨著處理時間延長,HCT 116和SW480細(xì)胞中的β-catenin蛋白表達(dá)水平均下降(圖1)。

    亞硒酸鈉對HCT116和SW480細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)的影響RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,隨著處理時間延長,HCT 116和SW480細(xì)胞中cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降(圖2)。

    蛋白酶體抑制劑MG132對亞硒酸鈉處理后HCT116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclinD1表達(dá)的影響將HCT 116和SW480細(xì)胞用MG132預(yù)處理1.5 h后,再用亞硒酸鈉處理24 h,提取總蛋白,Western blot檢測結(jié)果顯示,MG132與亞硒酸鈉聯(lián)合處理組HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)水平高于亞硒酸鈉單獨處理組 (圖3)。

    亞硒酸鈉對HCT116和SW480細(xì)胞中β-catenin與TCF4相互作用的影響用亞硒酸鈉處理HCT 116和SW480細(xì)胞24 h后,用RIPA裂解提取總蛋白,定量后分別用β-catenin抗體和TCF4抗體免疫共沉淀細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測結(jié)果顯示,亞硒酸鈉處理的HCT 116和SW480細(xì)胞中,β-catenin與TCF-4蛋白的結(jié)合明顯減少(圖4)。

    討 論

    β-catenin除了存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)通過鈣黏蛋白和肌動蛋白在細(xì)胞連接中發(fā)揮作用外,也是Wingless/Integrated(Wnt)信號通路中的重要成員,在沒有Wnt信號激活的情況下,胞質(zhì)游離的β-catenin可被由糖原合成激酶3β(glycogen Synthase 3β,GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1,CK1)等蛋白組成的蛋白破壞復(fù)合體降解,而當(dāng)Wnt脂多糖配體與Frizzled受體及低密度脂蛋白的受體相關(guān)蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)輔助受體結(jié)合后,可以募集接頭蛋白至細(xì)胞膜上,磷酸化的LRP5/6也可以募集CKI蛋白,從而使結(jié)腸腺瘤樣息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)/GSK3β不能有效啟動β-catenin的泛素化降解。積累的胞質(zhì)β-catenin能夠通過APC等蛋白的作用轉(zhuǎn)入核內(nèi),與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF4/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer-binding factor,LEF-1)相互結(jié)合,繼而結(jié)合到靶基因的啟動子位點促進(jìn)轉(zhuǎn)錄,從而達(dá)到維持腫瘤細(xì)胞生存的目的[7-8],同時β-catenin受到包括蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)、c-jun氨基端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)等眾多激酶所組成的信號網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控[9-11]。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn),超營養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉能夠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT 116和SW480發(fā)生細(xì)胞凋亡,本研究則觀察了亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT 116和SW480中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達(dá)的影響。

    A.RT-PCR檢測結(jié)果;B.Western blot檢測結(jié)果A.results of RT-PCR;B. results of Western blot analysis

    A.RT-PCR檢測結(jié)果;B.Western blot檢測結(jié)果A.results of RT-PCR;B. results of Western blot analysis

    圖3 MG132對亞硒酸鈉(10 μmol/L)處理后HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Fig3 Effect of MG132 on β-catenin and cyclin D1 in selenite-treated colorectal cancer cells HCT 116 and SW480 (10 μmol/L)

    A.β-catenin免疫共沉淀的Western blot結(jié)果;B. TCF4免疫共沉淀的Western blot結(jié)果A. results of Western blot analysis after β-catenin co-immunoprecipitation;B. results of Western blot analysis after TCF4 co-immunoprecipitation.

    本研究首先檢測了用亞硒酸鈉處理HCT 116和SW480細(xì)胞不同時間后β-catenin和cyclin D1的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能夠抑制HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá),但在轉(zhuǎn)錄水平,HCT 116和SW480細(xì)胞則表現(xiàn)出對亞硒酸鈉不同的敏感性,亞硒酸鈉能夠抑制HCT 116細(xì)胞中β-catenin的轉(zhuǎn)錄,但對SW480細(xì)胞則無影響,推測這可能是由細(xì)胞本身的基因型決定的。SW480細(xì)胞中β-catenin編碼基因完整性決定了其能夠被硒誘導(dǎo)的降解途徑所調(diào)控,所以轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出不敏感性;HCT 116細(xì)胞中的β-catenin基因是在編碼ser45的序列時突變的,造成其不能被APC/GSK3β破壞復(fù)合體所降解[12]。

    用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理的結(jié)果顯示,其可增加亞硒酸鈉處理后HCT 116和SW480細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá)水平,提示蛋白酶體抑制劑MG132可在一定程度上逆轉(zhuǎn)亞硒酸鈉所引起的β-catenin及其下游靶基因cyclin D1表達(dá)的抑制,說明可能存在除經(jīng)典的破壞復(fù)合體之外的分子介導(dǎo)β-catenin發(fā)生泛素化降解[13]。

    此外本研究還發(fā)現(xiàn),亞硒酸鈉能夠明顯破壞β-catenin與核內(nèi)輔助因子TCF4間的相互作用,提示可能還存在其他相互作用蛋白與β-catenin競爭性結(jié)合。有研究顯示,F(xiàn)orkhead box(FOXO)家族蛋白可能競爭性與β-catenin結(jié)合,阻止β-catenin與TCF4結(jié)合,從而抑制其靶基因cyclin D1和survivin等的轉(zhuǎn)錄[14-15]。FOXO家族蛋白也可通過促進(jìn)Bcl-2家族的促細(xì)胞凋亡蛋白,如Bim和Puma的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。

    綜上,本研究結(jié)果顯示,亞硒酸鈉可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT 116和SW480中β-catenin及cyclin D1的表達(dá)水平,蛋白酶體介導(dǎo)的降解途徑可能在這一過程中發(fā)揮了重要作用。亞硒酸鈉引起的β-catenin與TCF4相互作用減少可能對β-catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄也起到了一定的調(diào)控作用,這一系列的級聯(lián)反應(yīng)可能介導(dǎo)了亞硒酸鈉引起結(jié)直腸細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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    EffectsofSodiumSeleniteontheExpressionsofβ-cateninandItsTargetcyclinD1inColorectalCancerCellsHCT116andSW480

    LUO Hui, YANG Yang, XU Cai-min

    National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

    XU Cai-min Tel: 010-65296445, E-mail: caiminxu@yahoo.com.cn

    ObjectiveTo explore the effects of sodium selenite on the expressions of β-catenin and cyclin D1 in colorectal cancer cells HCT 116 and SW480.MethodsHCT 116 and SW480 cells were treated by 10μmol/L sodium selenite at different time points. The expressions and transcription of β-catenin and cyclin D1 were detected by Western blot analysis and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. Meanwhile, the impact of MG132 (a proteasome inhibitor) pretreatment on the expressions of β-catenin and cyclin D1 was observed through Western blot analysis. The interaction between β-catenin and T cell factor 4 (TCF4) after selenite treatment was evaluated using co-immunoprecipitation assay.ResultsSodium selenite inhibited the expression of β-catenin and transcription of its target such as cylcin D1. MG132 pretreatment prevented the inhibition of β-catenin signaling triggered by selenite in HCT 116 and SW480 cells. Furthermore, selenite treatment disrupted the interaction between β-catenin and TCF4 in HCT 116 and SW480 cells.ConclusionsSodium selenite can lower the expression levels of β-catenin and its target cyclin D1, during which the proteasome-mediated degradative pathway may be involved. The decreased interaction between β-catenin and TCF4 due to sodium selenite may be also involved in the regulation of β-catenin signaling.

    sodium selenite; colorectal cancer; β-catenin; cyclin D1

    ActaAcadMedSin,2011,33(6):654-658

    許彩民 電話:010-65296445,電子郵件:caiminxu@yahoo.com.cn

    Q735

    A

    1000-503X(2011)06-0654-05

    10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.014

    國家自然科學(xué)基金(31170788、30970655)、國家青年科學(xué)基金(31101018)、北京市自然科學(xué)基金(5082015)和國家重點實驗室專項經(jīng)費(2060204)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (31170788, 30970655), the National Natural Science Foundation for young scholars of China (31101018), the Natural Science Foundation of Beijing (5082015), and the National Laboratory of Molecular Biology Special Fund (2060204)

    2011-10-25)

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