β-catenin在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用

幸小亮,沙龍澤,張 丹,沈 巖,吳立文,許 琪

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100005

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100730

內(nèi)側(cè)顳葉癲癇是顳葉癲癇的主要類型,約占全部顳葉癲癇的70%,占所有癲癇的40%左右,是成人癲癇中最常見的類型,也是藥物癲癇中最常見的一種癲癇綜合征[1-2]。以往對顳葉癲癇的研究顯示,海馬硬化可能在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3-6],也是藥物難治性的重要原因[7-8]。2004年,Van Paesschen[9]研究發(fā)現(xiàn),在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇中,約70%可見海馬硬化,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元缺失、星型膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔狀纖維發(fā)芽等病理改變,常同時(shí)伴有顳葉萎縮。β-catenin是一種重要的細(xì)胞內(nèi)分子,在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和增殖[10]、神經(jīng)元樹突形態(tài)形成和突觸后膜興奮性中都具有重要作用[11-13]。本研究觀察了 β-catenin在癲癇模型小鼠海馬和內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者海馬中的表達(dá)情況,探討了其在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料和方法

材料 健康雄性8周齡C57BL/6小鼠43只,體重20～25 g,購自北京維通利華有限公司,采用SPF級、24 h明暗各半條件飼養(yǎng)。單臂腦力體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司),微型手持式顱鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司),0.5μl微量進(jìn)樣器Micro liter syringes(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。海人酸 (美國 Sigma公司),β-actin抗體 (美國 Cell Signaling Technology公司),β-catenin抗體 (美國Sigma公司),ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 (美國 Promega公司),膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體 (美國Abcam公司),熒光二抗 (美國Invitrogen公司),兔超敏二步法檢測試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),BCA蛋白定量檢測試劑盒 (碧云天生物技術(shù)研究所)。人海馬組織來自在北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)的內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者,其中4例有海馬硬化,4例無海馬硬化,本研究獲北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

動(dòng)物模型的建立及分組 采用腹腔注射10%水合氯醛 (100μl/20 g)麻醉小鼠,3～5 min進(jìn)入麻醉狀態(tài)。將小鼠頭顱固定在單臂腦力地定位以上,身體平趴。參照Kralic癲癇模型鼠建立模型[14],以前囟為坐標(biāo):前囟后 =-2.0 mm,中縫右 (mediolateral,ML)=1.8 mm,顱骨 (硬腦膜)平面向下(dorsoventral,DV)=-2.3 mm進(jìn)行右側(cè)海馬海人酸(12 mg/kg)顱內(nèi)注射,注射完成后用手術(shù)線縫合傷口,置于籠內(nèi)觀察飼養(yǎng)。癲癇發(fā)作按Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定:Ⅰ級:咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐;Ⅱ級:以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉抽搐;Ⅲ級:單側(cè)前肢陣攣、抽搐;Ⅳ級:雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;Ⅴ級:雙側(cè)后肢強(qiáng)直,身體背曲強(qiáng)直,跌倒伴全身陣攣[15]。以在急性期出現(xiàn)Ⅲ級及以上的發(fā)作持續(xù)1 h以上的行為學(xué)觀察認(rèn)為癲癇模型小鼠構(gòu)建成功,如果出現(xiàn)Ⅲ級及以上發(fā)作時(shí)間過長,則注射地西泮以緩解癲癇狀況。將43只小鼠分為空白對照組 (n=3)和海人酸 (n=40)注射組,海人酸注射組根據(jù)行為學(xué)觀察分為:急性期 (注射后6 h,n=8;注射后16 h,n=8)、靜止期 (注射后3 d,n=8;注射后5 d,n=8)和慢性期 (注射后5周,n=8)。

模型鼠海馬組織蛋白的提取及 β-catenin表達(dá)量檢測 采用斷頸法處死2只空白對照小鼠和5只模型小鼠,在2 min內(nèi)單獨(dú)分離出右側(cè)海馬,用凍存管放于液氮中保存待用。采用2%SDS裂解液提取海馬組織蛋白,以保證提取蛋白的完整性。將小鼠大腦海馬組織置于研缽中,采用液氮研磨法研磨至粉狀,加入250μl SDS蛋白裂解液回收,室溫靜止20 min,95℃加熱5 min,自然冷卻后離心取上清。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定,Western blot檢測海馬組織中 β-catenin表達(dá)量。同樣處死1只空白對照小鼠和3只模型小鼠,于1 min內(nèi)分離完整的大腦組織,浸泡在5%甲醛48 h,并逐級進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋,2μm切片,然后行HE染色觀察病理改變。

人海馬組織免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測 將經(jīng)手術(shù)切除的人海馬組織用生理鹽水清洗,然后再用4%甲醛浸泡48 h,并逐級進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋,2μm切片,采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測 β-catenin變化,觀察海馬病理改變。

結(jié) 果

建模結(jié)果 海人酸注射組40只小鼠中,有3只(7.5%)死亡,其中1只死于注射后16 h(急性期),2只死于注射后5周 (慢性期);所有小鼠經(jīng)行為學(xué)觀察證實(shí)內(nèi)側(cè)顳葉癲癇建模成功。HE染色結(jié)果顯示,急性期海馬角 (cornu ammonis,CA)3區(qū)病變發(fā)生最早,神經(jīng)元表現(xiàn)為明顯的丟失;隨時(shí)間發(fā)展,CA3區(qū)神經(jīng)元丟失程度加深,在靜止期進(jìn)一步加深,此時(shí)CA1區(qū)神經(jīng)元也開始逐步丟失;慢性期時(shí),齒狀回 (dentate gyrus,DG)出現(xiàn)明顯的顆粒細(xì)胞散布,壓縮海馬CA區(qū),特別是CA1區(qū),CA3區(qū)和CA1區(qū)神經(jīng)元基本完全消失 (圖1)。

圖1 模型小鼠海馬的病理變化 (HE, ×100)Fig 1 Pathological changes of hippocampus in model mice(HE,×100)

模型鼠海馬中 β-catenin的表達(dá)情況 Western blot檢測結(jié)果顯示,注射后6 h、16 h、3 d、5 d、5周,模型鼠注射側(cè)海馬中的 β-catenin蛋白表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變 (圖2)。

圖2 模型鼠注射側(cè)海馬 β-catenin表達(dá)量Fig 2 Western blot analysis of β-catenin expression in the hippocampus of mice model

人海馬組織的免疫熒光和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 免疫熒光檢測結(jié)果顯示,海馬硬化內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者的海馬中有明顯的星型膠質(zhì)細(xì)胞增生,在DG區(qū)存在顯著的顆粒細(xì)胞散布,神經(jīng)元大量丟失。βcatenin表達(dá)量在非海馬硬化內(nèi)側(cè)顳葉癲癇和海馬硬化內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者之間沒有明顯的改變 (圖3)。

圖3 人海馬組織免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測結(jié)果 (×400)Fig 3 Immunohistochemistry and immunofluorescence results of human hippocampus(×400)

討 論

內(nèi)側(cè)顳葉癲癇是一種局灶性癲癇,以反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn),其異常放電主要起源于大腦顳葉內(nèi)側(cè)位置[16]。多數(shù)內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者存在海馬硬化,手術(shù)切除硬化海馬組織對治療內(nèi)側(cè)顳葉癲癇異常放電具有顯著成效。β-catenin是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子,在胞膜、胞質(zhì)和胞核中都有存在[17-18],在調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新和增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用海人酸注射法構(gòu)建小鼠內(nèi)側(cè)顳葉癲癇模型,經(jīng)行為學(xué)觀察確認(rèn)所有小鼠造模成功,病理觀察亦顯示,DG區(qū)有顯著顆粒細(xì)胞散布,CA3和CA1區(qū)神經(jīng)元明顯丟失,病理學(xué)檢測存在有明顯海馬硬化現(xiàn)象,亦證實(shí)小鼠建模成功。對模型鼠海馬 β-catenin的Western blot檢測結(jié)果顯示,注射后6 h、16 h、3 d、5 d、5周,即急性期、靜止期和慢性期 β-catenin蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變;對非海馬硬化內(nèi)側(cè)顳葉癲癇與海馬硬化內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者海馬的免疫熒光和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果亦發(fā)現(xiàn),β-catenin的表達(dá)量在兩者之間也沒有差異;上述結(jié)果提示 β-catenin可能未參與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇海馬硬化的形成過程。

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