蛋>白激酶Nemo樣激酶基因重組腺病毒載體的構建與鑒定

程筱雯,梁俊波,繆時英,王琳芳

中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室,北京 100005

Nemo樣激酶 (nemo-like kinase,NLK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在果蠅、線蟲、爪蟾等多種生物中都存在NLK的同源蛋白,其結構存在高度的相似性,顯示NLK在進化過程中十分保守[1-4]。研究顯示,NLK能夠結合并磷酸化一系列轉錄因子,參與多個信號通路的調節(jié),其中包括與發(fā)育過程密切相關的信號途徑Wnt和Notch[5-7]等。Kortenjann等[8]研究發(fā)現,NLK基因敲除的C57BL/6胎鼠死于妊娠晚期;而129/Sv品系的NLK敲除小鼠雖能存活,但卻生長遲緩并伴有顯著的神經異常。最新研究表明,NLK參與調節(jié)了生物鐘的速度和果蠅的復眼轉動[9-10]。本課題組前期研究顯示,NLK可能與結直腸癌細胞HCT 116的增殖有關,但HCT 116細胞存在質粒難轉染、篩選困難、陽性率低等缺點,故筆者采取了利用病毒包裝目的基因感染靶細胞篩選穩(wěn)定單克隆細胞的策略。腺病毒載體具有宿主范圍廣、高轉染效率、高滴度、高表達、包裝容量大、安全性好等突出的優(yōu)勢[11-12],本研究旨在通過優(yōu)化重組腺病毒包裝條件構建NLK基因重組的腺病毒載體,篩選供研究所需的穩(wěn)定單克隆細胞,擬用于進一步研究NLK與細胞增殖的分子機制。

材料和方法

材料和試劑 pAdTrack-CMV-NLK及其突變體質粒由本課題組構建,測序鑒定正確,低代數的HEK293A包裝細胞由北京協和醫(yī)學院劉德培教授惠贈,BJ5183感受態(tài)細胞由北京協和醫(yī)學院方福德教授惠贈,Trans1-T1感受態(tài)細胞購自北京Transgene生物技術有限公司;引物合成 (美國Invitrogen公司),TRIzol(美國 Invitrogen公司),2 ×Tag Mix(美國GenStar公司),DNA聚合酶 (北京Transgene生物技術有限公司),玻璃奶膠回收試劑盒 (中國北京博大泰克生物基因技術有限責任公司),限制性核酸內切酶和T4 DNA連接酶 (英國NEB公司),DNA Marker(日本Takara公司),質粒抽提試劑盒 [天根生化科技 (北京)有限公司],Opti-MEM (美國 Gibco公司),FuGENE HD轉染試劑 (瑞士Roche公司),Vigorous轉染試劑、胎牛血清 (美國Gibco公司),α-MEM-N培養(yǎng)基 (北京協和醫(yī)學院細胞中心),高糖-DMEM培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司),Anti-FLAG單克隆抗體 (美國 Sigma公司),Anti-GAPDH單克隆抗體、HRP-goat anti Rabbit＆HRP-goat anti mouse antibody(羊抗兔及羊抗小鼠二抗,中杉金橋生物技術有限公司),Western Blotting Detection Reagent-ECL發(fā)光液 (中國Engreen公司)。

RT-PCR方法擴增NLK基因及其突變體NLKK155M、NLK-T286V和C425Y 采用新鮮培養(yǎng)的HEK293T細胞,RT-PCR方法從總RNA中擴增NLK的cDNA,具體如下:采用TRIzol提取總RNA,將總RNA反轉錄成cDNA,再進行PCR擴增。上、下游引物分別引入KpnI和XhoI酶切位點,同時C端引入FLAG tag(FLAG融合標簽由8個氨基酸組成-Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys,專門設計用于重組蛋白質的免疫吸附純化),擴增片段長度為1500 bp。PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min 30 s,共35個循環(huán)。GAPDH為內參,PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃40 s,共20個循環(huán)。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳成像系統鑒定,同時回收純化PCR產物。

重組過渡質粒pAdtrack-CMV的構建和鑒定將PCR產物和p Adtrack-CMV空載體 (GFP+)進行KpnI和XhoI雙酶切,雙酶切后的產物進行連接和轉化 (Kanr);從轉化的平板挑15個菌落,于300μl LB中 37℃,250 r/min振搖2 h,取 1μl作為模板進行PCR鑒定。PCR反應體系為20μl,如下:菌落模板1 μ 1+2 ×Tag Mix 10μl+Pri(上游 +下游 )0.5μl+ddH2O 8.5μl。取 PCR鑒定為陽性的克隆,送雙向測序。

重組過渡質粒pAdtrack-CMV-NLK及其突變體的Western blot鑒定 取PCR鑒定陽性且測序正確的重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體,以Vigorous轉染試劑瞬時轉染HEK293T細胞,48 h后收集細胞,以1×SDS細胞裂解液進行裂解,取上清以BCA法進行蛋白定量。取5μg上樣品進行電泳,160 kv,1 h→電轉320 mA,1 h→3%BSA/TBST封閉,室溫1 h→一抗室溫孵育1 h:anti-FLAG(FLAG標簽抗體,1∶3000,美國 Sigma公司);anti-GAPDH(抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體1∶3000,MS,中杉金橋生物技術有限公司)→1×TBST洗膜,10min×3次 →二抗室溫孵育1 h:HRP-goat anti Rabbit＆HRP-goat anti mouse antibody(1∶10000,羊抗兔及羊抗小鼠二抗,中杉金橋生物技術有限公司)→1×TBST洗膜,10 min×3次 →顯影。

陽性重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體的PmeI酶切線性化 將測序及表達正確的重組過渡質粒pAdtrack-CMV-NLK及其突變體用PmeI酶切使其線性化,100μl酶切反應體系如下:pAdtrack-CMV-NLK 1.5μg+10 ×Buffer 410μl+100 ×BSA lμl+PmeI 1μl+ddH2O 至反應 體積 100μl,37 ℃,16 h;玻璃奶膠純化試劑盒純化酶切產物,洗脫于30μl ddH2O 中 。

線性化陽性重組過渡質粒pAdtrack-CMV-NLK及其突變體電轉法轉入BJ5183感受態(tài)細胞 取100μl BJ5183感受態(tài)細胞 (已包含腺病毒骨架質粒pAdEasy-1)冰上融化,加入200 ng pAdTrack-CMV-Gene PmeI酶切產物,混勻轉移至冰浴預冷的0.2 cm電轉杯,避免形成氣泡。電轉化參數設定:2.5 kV (1.8～2.5 kV)、 200 Ω、 25 μ F, 時間4.5 ～5.0 ms電擊后,立即向電極杯中加入900μl LB (無抗生素),混勻,重懸后轉移到1.5 ml的離心管,37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,4000 r/min,5 min,150μl重懸后涂布帶有Kan(1∶2000使用)抗性的LB平板,37℃過夜培養(yǎng)16 h,進行細菌內同源重組。

PacI酶切線性化篩選pAdtrack-NLK及其突變體的同源重組體 取過夜培養(yǎng)的平板,挑12個較小的單克隆菌落,5 ml LB(含 25μg/ml Kan),37℃,振蕩培養(yǎng)8 h。小提質粒,測定濃度和純度,取500 ng重組質粒進行 PacI酶切線性化:50μl體系,質粒500 ng+10 ×Buffer15μl+100 ×BSA 1μl+PacI 1μl+ddH2O 至反 應 體 積 50μl,37 ℃,16 h,0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

PacI酶切并線性化陽性pAdtrack-NLK及其突變體同源重組體和乙醇沉淀法回收純化 將陽性同源重組pAd-NLK質粒轉入擴增菌Trans1-T1中進行擴增,提質粒,取6μg重組質粒進行 100μl體系 PacI酶切線性化,37℃,16 h。加入2.5倍體積無水乙醇,上下顛倒混勻,置于-20℃2 h。取出后4℃,15700 g,離心10 min,加入1 ml 75%乙醇漂洗,4℃,15700 g,離心5 min,細胞超凈臺內干燥10 min,加入20μl已60℃預熱的ddH2O溶解,60℃放置5 min。測定濃度和純度。

pAdtrack-NLK及其突變體重組腺病毒載體轉染HEK293A細胞進行病毒包裝 轉染前4 h將T25培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液吸棄,換用4 ml新鮮的 α-MEM-N培養(yǎng)基 (無抗生素)培養(yǎng);取2μg酶切純化的pAdtrack-NLK及其突變體重組腺病毒載體,加入8μl FuGENE HD轉染試劑和相應體積的Opti-MEM,混勻,室溫放置15 min,將混合物緩慢加入到鋪滿HEK293A細胞T25細胞培養(yǎng)瓶中,輕晃培養(yǎng)瓶,使之均勻的覆蓋在HEK293A細胞層上,將轉染的培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng),16 h后換液,加入8 ml新鮮 α-MEM-N培養(yǎng)基培養(yǎng)1周。

病毒原液的收集與擴增 pAdtrack-NLK及其突變體重組腺病毒載體轉染HEK293A細胞6 h后即可見到綠色熒光的表達,7 d左右觀察細胞形態(tài)及熒光:細胞發(fā)生腫脹、變圓、漂浮和死亡,帶有綠色熒光細胞占總細胞的比例接近100%,收集細胞經37℃與液氮之間反復凍融4次以充分裂解細胞釋放病毒,4℃,5900 g離心10 min,收集病毒原液,-80℃凍存。取適量病毒原液再次感染HEK293A細胞以大量擴增重組病毒。

Western blot鑒定 pAdTrack-CMV-NLK及其突變體重組腺病毒感染HCT 116細胞后NLK及其突變體蛋白的表達 取適量病毒液感染HCT116細胞,約48 h后收集細胞進行Western blot,步驟同重組過渡質粒pAdtrack-CMV的Western blot鑒定。

結 果

PCR篩選鑒定陽性重組質粒pAdTrack-CMV-NLK 將PCR擴增出的NLK及其突變體目的片段產物和 pAdtrack-CMV空載體進行KpnI和XhoⅠ雙酶切,雙酶切后的產物進行連接和轉化 (Kanr),挑取一定數量克隆PCR鑒定,結果示NLK及其突變體均有構建成功的重組克隆 (圖1)。

Western blot鑒定陽性重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK的表達 取PCR鑒定陽性且測序正確的重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體,以Vigorous轉染試劑瞬時轉染HEK293T細胞,48 h后收集細胞進行蛋白定量和Western blot檢測確認是否能在真核細胞中表達,結果示NLK及其突變體正常表達 (圖2)。

圖1 重組質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體的鑒定Fig 1 PCR identification of NLK(and mutants)recombinant adenoviral expression plasmid

圖2 重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體表達的Western blot鑒定Fig 2 Identification of NLK(and mutant)recombinant adenoviral expression plasmid by Western blot analysis

PacI酶切線性化篩選同源重組pAdTrack-CMVNLK及其突變體 將測序及表達正確的重組過渡質粒pAdtrack-CMV-NLK及其突變體用PmeI酶切使其線性化,電轉法轉入BJ5183感受態(tài)細胞 (pAdEasy-1+)進行同源重組。PacI酶切線性化篩選pAdTrack-CMV-NLK及其突變體的同源重組克隆,結果示NLK及其突變體均有成功同源重組的克隆,純化后質粒經PacI酶切,使其暴露出反向終止重復序列 (ITR)。經PacI酶切,重組質粒中可見產生1條大于20 kb的帶和約3000 bp或5000 bp的特征性帶 (圖3)。

重組腺病毒在低代數HEK293A細胞中的包裝采用高效低毒高穩(wěn)定性的FuGENE HD轉染試劑將PacI酶切后的重組腺病毒pAdtrack-NLK及其突變體載體導入HEK293A細胞以包裝產生重組腺病毒,轉染HEK293A細胞6 h后即可見到綠色熒光蛋白GFP的表達,7 d后在光鏡下觀察到細胞的病毒效應導致細胞發(fā)生腫脹、變圓、漂浮和死亡。表達綠色熒光蛋白的包裝細胞占總細胞的比例接近100%(圖 4)。

Western blot鑒定NLK基因及其突變體重組腺病毒感染HCT116細胞后NLK基因及其突變體蛋白的表達 取適量病毒液感染HCT 116細胞,約48 h后收集細胞進行Western blot檢測,結果顯示pAdTrack-CMV-NLK及其突變體均有正確表達 (圖5)。

圖3 PacI酶切線性化篩選同源重組pAdtrack-CMV-NLK及其突變體克隆Fig 3 Identification of recombinant plasmid pAdtrack-CMV-NLK(and mutants)cut with restriction enzyme PacI

圖4 重組腺病毒在低代數HEK293A細胞中的包裝 (熒光表達情況)Fig 4 Observation of the GFP expression in HEK293A cell after having been transfected with recombinant plasmid pAdTrack-CMV-NLK(and mutants)

圖5 Western blot鑒定攜帶NLK基因及其突變體的重組腺病毒感染HCT116細胞后NLK基因及其突變體蛋白的表達Fig 5 Identification of expression of NLK (and mutant)after infected with pAdTrack-CMV-NLK(and mutants)recombinant adenovirus in HCT 116 cells by Western blot analysis

討 論

NLK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其在進化過程中十分保守。有研究顯示,NLK能夠結合并磷酸化一系列轉錄因子,參與多個信號通路的調節(jié),其中包括Wnt和Notch等與發(fā)育過程密切相關的信號途徑。Wnt/β-catenin信號通路對生物發(fā)育過程至關重要,該通路活化后,胞質中的 β-catenin解除受抑制狀態(tài)進入細胞核,與轉錄因子淋巴增強因子1(lymphoid enhancer factor,LEF1)/T細胞因子 (T cell factor,TCF4)形成轉錄復合物開啟下游基因的表達,NLK能夠直接結合并磷酸化LEF1/TCF4,降低LEF1/TCF4的轉錄活性,抑制Wnt/β-catenin信號通路[13]。同時,NLK的活化又依賴于Wnt信號所引發(fā)的轉化生長因子 β活化激酶 (transforming growth factor β activated kinase 1,TAK1)的激活及對NLK的磷酸化[14]。因此,目前認為NLK在Wnt信號通路中發(fā)揮負反饋調節(jié)作用[12]。

本課題組前期研究以結直腸癌細胞HCT 116為靶細胞構建了NLK基因敲除細胞,初步實驗結果顯示NLK可能與細胞增殖有關,為了進一步研究NLK在腫瘤細胞生長增殖過程中的功能,擬準備進行NLK基因敲除細胞的恢復實驗,同時也為了排除實驗中質粒瞬時轉染對實驗結果的不利影響,還進行了質粒穩(wěn)定轉染擬準備篩選穩(wěn)定克隆進行實驗,但由于質粒轉染HCT 116細胞效率低、篩選困難、耗時長、陽性率低且質粒容易丟失,故采取了利用病毒包裝感染靶細胞篩選穩(wěn)定單克隆細胞。腺病毒載體的靶細胞種類多,導入效率高,不引起插入突變,容易得到高滴度病毒。因此本研究優(yōu)化重組病毒包裝條件構建了NLK基因重組的腺病毒載體,篩選穩(wěn)定單克隆細胞,以用于進一步研究NLK與細胞增殖的分子機制。

本研究所采用的腺病毒載體系統The AdEasy system如下:(1)9220 bp,Kanr的穿梭質粒pAdTrack-CMV,插入片段前含有CMV啟動子,插入片段后含有多聚腺苷酸信號,有多克隆位點:BglⅡ、KpnⅠ、SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、Eco RV;獨立表達報告基因綠色熒光蛋白 (GFP),在轉染和感染細胞后用熒光顯微鏡觀察方便直接;有線性化酶切位點:Pme I和Pac I;最大插入片段大小:5.0 kb。(2)腺病毒骨架質粒pAdEasy-1:33414 bp、Ampr;E1和E3雙缺陷載體;線性化酶切位點:Pac I,也包含Bam HI、Eco RI酶切位點。(3)同源重組菌株E.coli BJ5183:genotype:endA,sbcB-,recBC-,strR;Hanahan and Gl μ zman,1984;recA不突變,可高效穩(wěn)定地產生同源重組;已含pAdEasy-1。(4)擴增質粒菌株:DH10B、TOP10、DH5 α,不傾向于發(fā)生重組。(5)包裝細胞系293或911:293細胞:E1轉化的人胚腎細胞,表達 E1;AD-293(Stratagene#240085)。(6)生物安全:Biosafety Level 2(BL2)。

在構建重組腺病毒過程中,本研究對傳統的重組腺病毒包裝方法進行了細節(jié)上的改進:(1)所使用的卡那霉素濃度降低 (50μg/ml),以利于細菌的生長。(2)重組過渡質粒在PCR和測序鑒定正確后,進一步采用Western blot鑒定陽性重組過渡質粒是否能在真核細胞中表達,以十分肯定在后續(xù)病毒包裝前的步驟準確無誤。(3)轉染HEK293A細胞前用乙醇沉淀法替代傳統的酚-氯仿-異戊醇法回收PacI酶切產物,簡便快捷。(4)轉染HEK293A細胞時,本研究采用高效低毒穩(wěn)定性強的轉染試劑FuGENE HD代替?zhèn)鹘y的lipofectamin 2000,易于操作,無需洗滌和更換培養(yǎng)基,使得操作程序簡化。(5)為便于本研究后續(xù)的蛋白表達檢測,在克隆的NLK基因C端添加了FLAG tag。用KpnI和XhoⅠ雙酶切PCR產物和pAdTrack-CMV空載后,進行定向連接、轉化,雙向測序鑒定,證實插入的NLK基因序列和方向均正確。將成功構建的重組過渡質粒pAdTrack-CMVNLK用PmeI酶切線性化后,電轉入已經包含腺病毒骨架質粒的BJ5183感受態(tài)細胞進行同源重組,PCR鑒定獲得了滿意的結果。腺病毒基因組兩側為逆向末端重復序列,其中含有基因組復制和包裝序列,因此需要將得到的重組腺病毒載體用PacI酶切線性化,暴露其反向末端重復序列,轉染HEK293A細胞后產生重組病毒顆粒。HEK293A細胞在健康狀態(tài)時呈拉網狀并貼壁形成單層細胞,隨著病毒的增殖,細胞變圓脫落,即出現了細胞病變效應。據此可以判斷重組腺病毒載體在HEK293 A細胞中的包裝情況。將該重組病毒感染實驗所需靶細胞——HCT 116細胞,檢測到了NLK及其突變體蛋白的表達,已能滿足實驗需要,為下一步用于篩選穩(wěn)定的單克隆細胞進行NLK與細胞增殖關系的研究奠定了基礎。

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