激活瞬時受體電位香草醛亞家族1抑制RhoA/Rho激酶改善高脂介導(dǎo)的血管舒張功能異常

朱振宇,張莉莉,王沛堅,馬麗群,王利娟,劉道燕,祝之明

第三軍醫(yī)大學(xué)全軍高血壓代謝病中心 重慶大坪醫(yī)院高血壓內(nèi)分泌科 重慶市高血壓研究所,重慶 400042

高血壓是影響人類健康的重大慢性疾病,也是腦卒中、冠心病和心腎功能衰竭的主要原因,其發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用有關(guān)[1]。流行病學(xué)研究表明,多種飲食因素,如:膳食高脂、鈉和鉀的含量,均可影響血壓[2]。瞬時受體電位通道香草醛類受體1型 (transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),也稱為辣椒素受體,在心血管代謝疾病中的作用近年來頗受關(guān)注[3-4]。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn),膳食辣椒素能夠激活血管內(nèi)皮TRPV1,促進eNOS/NO通路,降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[5];激活TRPV1能夠減輕高鹽攝入誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,減少超氧陰離子的產(chǎn)生,提高NO的生物利用度,從而改善高鹽膳食導(dǎo)致的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙及降低高鹽攝入導(dǎo)致的血壓升高[6]。激活TRPV1改善血管功能除與內(nèi)皮功能改善[5]外,是否還涉及其他機制,如電壓依賴的鉀通道,值得進一步探討。

Rho是哺乳類動物Ras基因超家族的一個亞群,被稱為小GTP結(jié)合蛋白。Rho主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架,與細(xì)胞的變形、運動、細(xì)胞分裂等有關(guān),也參與平滑肌收縮過程中對鈣敏感性的調(diào)節(jié)[7]。已有研究提示,RhoA和Rho激酶 (Rock)信號通路的激活可導(dǎo)致血管平滑肌收縮,血管張力增加,進而引起血壓升高[8];應(yīng)用RhoA/Rho激酶的抑制劑能夠降低血壓。本課題組既往研究顯示,噻嗪類利尿劑的抗高血壓機制也與抑制RhoA/Rho激酶信號通路有關(guān)[9]。但激活TRPV1是否影響RhoA/Rho激酶信號通路并不清楚。本研究主要探討激活TRPV1對于高脂飲食介導(dǎo)的血管功能異常的影響,以及鉀通道和RhoA/Rho激酶在其中的作用。

材料和方法

動物及分組 雄性10周齡C57BL/6J小鼠80只,體重21～22 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心提供;采用隨機表法分為普通飲食組、普通飲食 +辣椒素組、高脂飲食組、高脂飲食 +辣椒素組4組,每組20只。辣椒素添加濃度為0.01%。小鼠分籠,自由進食飲水。自然晝夜采光,室溫22～24℃,每日早晚喂食、換水。

主要試劑和儀器 鼠尾血壓測量儀(Powerlab2/25,澳大利亞ADI公司),小血管張力測定儀 (Multi wire myograph system,丹麥DMT公司),多導(dǎo)生理記錄儀(Powerlab/8SP,ADI,澳大利亞ADI公司),全自動生化分析儀 (Beckman Coulter Synchron Lx20,美國Bio-Rad公司),PCR儀 (PTC-200,美國GENE公司),凝膠掃描成像系統(tǒng) (Gel Doc 2000,美國Bio-Rad公司),比率熒光成像系統(tǒng) (PTI104B,美國PTI公司),倒置熒光顯微鏡 (TE2000-U,日本NIKON公司)。辣椒素、辣椒卓平、Fura-2/AM、Pluronic F-127(美國Sigma公司),α-actin抗體、β-actin抗體、抗TRPV1抗體、抗Kv1.4抗體、抗RhoA抗體、抗Rock1抗體 (美國Santa Cruze公司)。

平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞:C57BL/6J小鼠腹腔注射10%烏拉坦麻醉,分離并取出胸主動脈,顯微鏡下迅速除去脂肪和結(jié)締組織,PBS清洗3次,除去內(nèi)外膜,將中膜剪成1 mm×1 mm大小組織塊,移入25 ml培養(yǎng)瓶中,用尖嘴彎管均勻貼好組織塊,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 h,組織塊貼壁后,加入2.5 ml含10%小牛血清的DMEM中,放回培養(yǎng)箱中,3 d后可見組織塊周圍有細(xì)胞長出,培養(yǎng)2周后可觀察到長滿的平滑肌細(xì)胞。傳代3次分離的細(xì)胞用 α-actin抗體通過免疫組織化學(xué)法染色鑒定為平滑肌細(xì)胞。

RT-PCR 按照文獻(xiàn) [10]所述方法提取平滑肌細(xì)胞 RNA。TRPV1引物序列為:上游:5′-TGCCCTATCATCACCGTCAG-3′, 下 游:5′-CAGTGCCATGTTCCGCCTTT-3′。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,65℃退火30 s,72℃延伸40 s,循環(huán)35次,72℃再延伸10 min,取出反應(yīng)管置4℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外熒光燈下觀察,凝膠成像系統(tǒng)掃描。

平滑肌細(xì)胞中TRPV1表達(dá)的免疫組織化學(xué)法檢測 傳代3次分離的原代平滑肌細(xì)胞接種于無菌蓋片上,甲醛固定,雙氧水甲醇溶液去除內(nèi)源性過氧化物,蒸餾水清洗后5%BSA封閉液封閉,加1∶100稀釋的一抗 (TRPV1抗體)孵育,4℃過夜。陰性對照滴加相應(yīng)劑量PBS;PBS清洗,滴加IgG,PBS清洗,滴加SABC,PBS清洗,DAB顯色;蘇木素復(fù)染,清水洗滌;晾干,封片,TE2000-U倒置熒光顯微鏡下觀察,結(jié)合NIS-Elements成像軟件照相。

血管鈣信號測定 分離腸系膜動脈一級分支,置于6孔板中,每孔加入1 ml生理鹽溶液 (physiological saline solution,PSS) 并 加 入 4μmol/L Fura-2/AM和0.02%Pluronic F-127,置37℃孵箱中避光孵育1 h,取出血管置于2 cm ×2 cm玻片上,用PSS液沖洗血管3次,去除細(xì)胞外殘余的Fura-2/AM;將負(fù)載Fura-2/AM的腸系膜動脈置于熒光顯微鏡下(PTI104B),鈣熒光的激發(fā)波長為340 nm/380 nm,發(fā)射波長為510 nm;熒光信號經(jīng)Felix專用軟件處理。以游離鈣與結(jié)合鈣熒光強度之比Ratio(即在波長為510 nm的紫外光發(fā)射情況下,340 nm/380 nm之紫外光強度之比,前者代表游離鈣,后者代表結(jié)合鈣)反映血管鈣信號的變化,Ratio曲線升高表明游離鈣升高。先測定基礎(chǔ)狀況下血管Ratio曲線情況,然后觀察并記錄在300 s內(nèi)不同濃度辣椒素刺激下各組血管引起的Ratio曲線改變,計算Ratio曲線的升高幅度 [升高幅度 =(最高值-基礎(chǔ)值)/基礎(chǔ)值 ×100%]。

鼠尾血壓測量 采用無創(chuàng)方法,通過鼠尾血壓測量儀 (Powerlab2/25澳大利亞)測定小鼠清醒、安靜狀態(tài)下鼠尾血壓,分別在干預(yù)開始時和干預(yù)后每4周測定。

血管環(huán)實驗 C57BL/6J小鼠用10%烏拉坦腹腔注射麻醉后,取出胸主動脈,顯微鏡下清除血管周圍脂肪和結(jié)締組織。制備長約2.5 mm的血管環(huán),直徑40μm的不銹鋼絲懸掛血管環(huán)于小血管張力測定儀的浴槽中,持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體,37℃孵育。調(diào)節(jié)初張力,待張力曲線穩(wěn)定后,加入60 mmol/L的KCl,觀察血管環(huán)對KCl的收縮反應(yīng)。更換血管環(huán)液,加入去甲腎上腺素 (norepinephrine,NE)(10-7mol/L)刺激血管環(huán)收縮,待達(dá)穩(wěn)定收縮平臺后加入乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)(10-6mol/L),觀察血管環(huán)在NE誘發(fā)的收縮狀態(tài)下對內(nèi)皮依賴性舒張藥物ACh的反應(yīng);更換血管環(huán)液,加入 NE(10-7mol/L)刺激血管環(huán)收縮,待達(dá)穩(wěn)定收縮平臺后加入硝酸甘油 (nitroglycerin,NTG)(10-7mol/L),觀察血管環(huán)在NE誘發(fā)的收縮狀態(tài)下對非內(nèi)皮依賴性舒張藥物NTG的反應(yīng)。血管收縮反應(yīng)的大小以NE(10-7mol/L)所致收縮幅值 (峰值-基礎(chǔ)值)占KCl(60 mmol/L)所致收縮幅值的百分比表示。舒張反應(yīng)大小則以舒張幅值 (峰值-最低值)占10-7mol/L NE所致收縮幅比值表示,其中內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)以ACh(10-6mol/L)所致舒張幅值占10-7mol/L NE所致收縮幅值之比表示;非內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)以NTG(10-7mol/L)所致舒張幅值占NE所致收縮幅值之比表示。

蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測主動脈中目的蛋白的表達(dá):取100 mg小鼠主動脈組織加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液 (蛋白質(zhì)勻漿緩沖液1 ml加 PMSF 50μg,Leuptin 5μg) 裂解 組織 , 提 取總 蛋白,Beckman紫外分光光度儀測定蛋白濃度。蛋白上樣量50μg,經(jīng) SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上,封閉后加入一抗 (1∶1000 TRPV1、Kv1.4、RhoA、Rock1抗體),二抗 (1∶2000對應(yīng)二抗),進行抗原抗體反應(yīng),化學(xué)發(fā)光試劑增強反應(yīng),X線片壓片曝光,凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

結(jié) 果

TRPV1在血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中有TRPV1 mRNA表達(dá),PCR產(chǎn)物長度約435 kb(圖1A);Western blot檢測結(jié)果顯示,血管平滑肌細(xì)胞中有TRPV1蛋白表達(dá),其相對分子質(zhì)量約為95000(圖1B);采用TRPV1抗體進行的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實,培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中有較多的TRPV1分布 (圖2)。

激活TRPV1對血管鈣信號的影響 采用不同濃度辣椒素刺激腸系膜動脈后,結(jié)果顯示隨著辣椒素濃度的增加,[Ca2+]i的升高幅度明顯增加,對辣椒素刺激呈濃度依賴性反應(yīng) (P＜0.05)(圖3A)。預(yù)先用 TRPV1的拮抗劑辣椒卓平 (1μmol/L)孵育血管5 min,結(jié)果顯示辣椒素 (1μmol/L)誘導(dǎo)的 [Ca2+]i升高幅度明顯降低 (P＜0.05)(圖3B)。

激活TRPV1對血管反應(yīng)性的作用 高脂飲食組內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)分別為 (26±12)%和 (18.9±13.0)%,均明顯低于普通飲食組的100%和100%(P均 ＜0.01)。高脂飲食 +辣椒素組的內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)分別為(69±15)%和 (46.5±6.0)%,均明顯高于高脂飲食組 (P均 ＜0.05),但仍明顯低于普通飲食組 (P＜0.05,P＜0.01);各組間的收縮反應(yīng)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P均 ＞0.05)。

圖1 TRPV1在C57BL/6J小鼠VSMC中的表達(dá)Fig 1 Expression of TRPV1 in the VSMC of C57BL/6J mice

圖2 原代培養(yǎng)C57BL/6J小鼠VSMC的 α-actin和TRPV1免疫組織化學(xué)染色Fig 2 α-actin and TRPV1 immunohistochemistry in primary cultured VSMC of C57BL/6J mice

圖3 辣椒素激活TRPV1對C57BL/6J小鼠腸系膜動脈 [Ca2+]i的影響 (n=5)Fig 3 Dietary capsaicin-activated TRPV1 on[Ca2+]i of mesenteric artery in C57BL/6J mice (n=5)

激活TRPV1對血壓的作用 高脂飲食組大鼠的血壓為 (134.75±6.85)mmHg,明顯高于普通飲食組的 (115.667±4.69)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)(P＜0.05);高脂飲食 +辣椒素組大鼠的血壓為(130.25±3.77)mmHg,與高脂飲食組大鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

激活TRPV1對血管鉀通道和RhoA/Rho激酶表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示,普通飲食 +辣椒素組大鼠的Kv1.4蛋白表達(dá)明顯高于普通飲食組 (P＜0.05),高脂飲食 +辣椒素組大鼠的Kv1.4蛋白表達(dá)明顯高于高脂飲食組 (P＜0.05);高脂飲食組大鼠RhoA和Rho激酶蛋白的表達(dá)明顯高于普通飲食組 (P＜0.05),普通飲食 +辣椒素組明顯低于普通飲食組 (P＜0.05),高脂飲食 +辣椒素組明顯低于高脂飲食組 (P＜0.05)(圖4)。

討 論

高血壓及其血管功能異常還涉及鉀通道功能異常與血管鈣的敏感性失調(diào)[11-12]。近年研究表明,分子鳥苷酸結(jié)合蛋白,即小G蛋白,RhoA及其Rho激酶在血管鈣敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,并參與高血壓的病理生理過程。有報道在L-NAME誘導(dǎo)的高血壓模型中,主動脈RhoA/Rho激酶的活性均升高,給予Rho激酶抑制劑可降低血壓。同時,血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑可以抑制L-NAME誘導(dǎo)的高血壓動物的主動脈RhoA/Rho激酶的高表達(dá)[13]。Denniss等[14]研究提示,遺傳性高血壓大鼠 (spontaneously hypertensive rat,SHR)的血管RhoA/Rho激酶活性升高,給予RhoA/Rho激酶抑制劑法舒地爾干預(yù)后,可以降低SHR的血壓,但是對于正常血壓的WKY大鼠則沒有降低作用[15]。本研究結(jié)果顯示,高脂飲食可導(dǎo)致小鼠血管舒張功能異常及血壓升高,RhoA/Rho激酶的表達(dá)顯著增加,提示高脂誘導(dǎo)的血壓升高可能與RhoA/Rho激酶通路的激活有關(guān)。

高血壓及血管損害的防治除應(yīng)用各種降壓調(diào)脂藥以外,生活方式改變,如健康膳食發(fā)揮著重要作用。有研究證實,膳食辣椒素對心血管代謝有保護作用[16],有關(guān)辣椒素作用其靶點TRPV1參與血管功能和血壓的調(diào)控已被許多研究證實。本研究結(jié)果顯示,小鼠血管上存在TRPV1表達(dá)及分布,并可被辣椒素激活。長期給予辣椒素干預(yù)后,血管的內(nèi)皮依賴及非依賴的舒張功能均得到改善。有報道激活血管TRPV1除可導(dǎo)致內(nèi)皮依賴的血管舒張外[5],還激活鉀通道[17]。本研究結(jié)果顯示,辣椒素飲食干預(yù)組的鉀通道蛋白表達(dá)升高,由于鉀離子通道的內(nèi)向電流作用對細(xì)胞鈣有一定依賴性[18],因此辣椒素激活TRPV1介導(dǎo)的鈣信號可能對激活鉀通道有一定作用。有報道顯示,特異性阻斷鉀通道功能可增加小鼠大小血管的Rho激酶活性[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),辣椒素干預(yù)組小鼠血管的RhoA/Rho激酶蛋白表達(dá)明顯降低,提示辣椒素激活TRPV1上調(diào)鉀通道也可能與其抑制RhoA/Rho激酶有關(guān)。

圖4 各組大鼠Kv 1.4、RhoA和Rho激酶蛋白表達(dá)的比較 (n=3)Fig 4 Comparison of the expressions of Kv 1.4,RhoA,and Rho kinase protein among all groups(n=3)

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