蛋白連接組織生長(zhǎng)因子表達(dá)腺病毒的構(gòu)建及其基因功能

宮 寧,章華兵,方福德,常永生

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100005

蛋白連接組織生長(zhǎng)因子 (connective tissue growth factor,CTGF),是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為36000～38000的富含半胱氨酸的肝素結(jié)合蛋白,一個(gè)高度保守的CCN家族成員,CCN是由這個(gè)家族3個(gè)主要成員CTGF、富含半胱氨酸-61(Cysteine-rich 61,Cyr-61)、腎胚細(xì)胞瘤過表達(dá)基因 (nephroblastoma overexpressed gene,Nov)的英文首字母衍生出來的縮寫[1]。研究表明,在腎小球系膜上CCN2能夠激活Wnt途徑[2]。體外研究發(fā)現(xiàn),CTGF在幾種細(xì)胞中都能被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)所誘導(dǎo),包括人的真皮細(xì)胞[3]。在體外TGF-β1能夠高親和力結(jié)合到3T3-L1細(xì)胞的原生質(zhì)膜上,并且能夠抑制脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[4]。在纖維化癥中,CTGF是 TGF-β1下游的介質(zhì)[5]。糖尿病型心肌病被定性為間質(zhì)纖維化、心肌肥大和細(xì)胞凋亡,而CTGF參與纖維化過程[6]。在鏈唑霉素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠中,CTGF表達(dá)量上升。高濃度葡萄糖能夠刺激TGF-β1表達(dá),而腎小球系膜細(xì)胞的TGF-β1引發(fā)了 CTGF的表達(dá)。高糖誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)能夠被抗TGF-β1抗體和蛋白激酶C抑制劑GF109203X所抑制[7]。在糖尿病小鼠心肌細(xì)胞中CTGF表達(dá)量升高[8]。到目前為止,CTGF在糖脂代謝方面的作用研究比較少,功能尚不清楚。對(duì)CTGF基因的深入研究將有望成為肥胖、糖尿病、脂肪肝等代謝疾病的治療靶點(diǎn)。本研究構(gòu)建及鑒定了CTGF基因過表達(dá)腺病毒,初步探究了CTGF在糖脂代謝方面的功能。

材料和方法

材料 CTGF擴(kuò)增序列引物 (美國Invitrogen公司),擴(kuò)增序列:5′-CTGCTGTGCATCCTCCTACC-3′(正向),5′-AATGAGTTCGTGTCCCTTACTTC-3 ′(反向);兩端分別添加Kpn I和Xba I酶切位點(diǎn),C端加Flag標(biāo)簽。Kpn I和Xba I酶、T4 DNA連接酶、pyrobest Taq DNA聚合酶、dNTP(日本Takara公司),T-easy質(zhì)粒、實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒 (美國 Promega公司),Lipofectamine2000、細(xì)胞培養(yǎng)所用培基 (美國Invitrogen公司),pAdTrack-CMV和pAdTrack-U6由本實(shí)驗(yàn)室保存,逆轉(zhuǎn)率試劑盒 (美國ABI公司)。C57/BL6小鼠20只,7～8周齡,體重22 g～25 g,購自維通利華公司。

CTGF基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及腺病毒包裝 將測(cè)序正確連在T-easy質(zhì)粒上的CTGF酶切下來,定向連入穿梭載體pAdTrack-CMV。提取穿梭質(zhì)粒,取5 ug經(jīng)Pme I酶切7 h充分線性化,酚氯仿抽提,溶于20μl去離子水中。取100 ～500 ng酶切質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。以500μl LB培養(yǎng)基重懸細(xì)菌,涂于卡那霉素抗性的LB平板,置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h。挑取較小的克隆搖床過夜,提質(zhì)粒,經(jīng)Pac I酶切可得30 kb和4.5 kb兩條帶或者30 kb和3.0 kb兩條帶,即為陽性克隆。將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,挑菌培養(yǎng)提質(zhì)粒。取12μg所得的重組質(zhì)粒用 Pac I酶切 7～9 h,經(jīng)酚氯仿抽提,乙醇沉淀后,溶于去離子水。將回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)染密度50%～70%接種于T-25培養(yǎng)瓶的293A細(xì)胞,按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染。孵箱中培養(yǎng)10～15 d,不用換培養(yǎng)基,每天或隔天補(bǔ)500μl DMEM完全培養(yǎng)基。一般轉(zhuǎn)染5～7 d后可以通過熒光顯微鏡觀察到GFP斑。

CTGF腺病毒的擴(kuò)增 轉(zhuǎn)染后10～12 d,將細(xì)胞吹下來,轉(zhuǎn)入50 ml離心管 (或15 ml),如果轉(zhuǎn)染效率低 (＜30%),可在15 d以后再收集細(xì)胞,重懸于PBS中,液氮-37℃,反復(fù)凍融4次,收集病毒裂解液。第2輪擴(kuò)增,加病毒裂解液到2個(gè)T-25瓶子 (接種293A細(xì)胞,匯合度90%),細(xì)胞全部呈綠色且30%～50%細(xì)胞懸浮時(shí),收集細(xì)胞,重懸于PBS中,液氮-37℃,反復(fù)凍融4次,收集病毒裂解液。第3輪擴(kuò)增,加病毒于10個(gè)100 mm大皿中(接種293A細(xì)胞,匯合度90%),其余步驟同第2輪擴(kuò)增。

細(xì)胞培養(yǎng)及用腺病毒感染小鼠肝原代細(xì)胞 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293A細(xì)胞,培養(yǎng)基中添加100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。細(xì)胞在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。用經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲取成活率為90%以上的小鼠肝臟原代細(xì)胞,鋪至6孔板中,用1640(10%的血清,100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)培養(yǎng),感染病毒前換新鮮的培養(yǎng)基。每個(gè)孔加120感染復(fù)數(shù)的病毒。

總RNA提取和Real-time PCR 按照TRIzol(美國Invitrogen公司)說明書提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)定量,取2μg RNA加入random primer用Multi Scribe反轉(zhuǎn)錄酶 (美國ABI公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在IQ5儀器 (美國BIO-RAD公司)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。條件為:95℃10 min,95℃30 s、58℃30 s、72℃30 s(捕捉熒光值),循環(huán)40次,并作溶解曲線。CTGF:上游引物 5′-TCTCCACCCGAGTTACCAATG-3′,下游引物 5′-CACCCCGCAGAACTTAGCC-3 ′。PGC1 α:上游引物 5′-GACATAGAGTGTGCTGCTCTG-3′,下游引物5′-CATTGTTGTACTGGTTGGATATG-3 ′。

Western blot 等量蛋白樣品以SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)分離;電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,電轉(zhuǎn)1.5 h,封閉液室溫封閉PVDF膜1.5 h;PVDF膜置于一抗 (anti-Flag:1∶8000)溶液中,4℃搖床過夜;TBST洗PVDF膜4次,每次10 min;PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (用TBST配制的2.5%BSA以1∶5000稀釋)室溫作用1～2 h;TBST洗PVDF膜4次,每次10 min;將ECL液體以0.1 ml/cm2膜的用量滴加在PVDF膜上,室溫1 min。迅速吸去多余的ECL液體,用保鮮膜包好PVDF膜,暗室曝光。

小鼠禁食處理 10只C57/BL6小鼠分別進(jìn)行如下處理:編號(hào)1、2小鼠正常喂食3 d,處死,取肝臟提RNA;編號(hào)3、4小鼠饑餓12 h,處死,取肝臟提RNA;編號(hào)5、6小鼠饑餓12 h,重新喂食12 h,處死,取肝臟提RNA;編號(hào)7、8小鼠饑餓48 h,處死,取肝臟提RNA;編號(hào)9、10小鼠饑餓48 h,重新喂食12 h,處死,取肝臟提RNA。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以3次以上結(jié)果的平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,差異比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CTGF基因克隆、過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增約1000 bp左右片段,連接T-easy載體,經(jīng)過測(cè)序與NCBI上報(bào)導(dǎo)的序列一致,擴(kuò)增過表達(dá)質(zhì)粒帶有Kpn I和Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn),N端加kozak序列,C端加Flag標(biāo)簽。過表達(dá)質(zhì)粒通過Kpn I和Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)定向連入pAdTrack-CMV中,Pme I消化質(zhì)粒,線性化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli BJ5183(帶有pAdEasy-1)。挑菌培養(yǎng)提質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切,發(fā)現(xiàn)陽性重組菌產(chǎn)生30.0 kb和4.5 kb左右的兩條帶 (圖1)。

圖1 CTGF重組質(zhì)粒Pac I酶切鑒定Fig 1 Identification of the recombinant plasmid ofCTGF after Pac I digestion

CTGF基因過表達(dá)腺病毒的包裝及肝原代水平驗(yàn)證其表達(dá) Pac I線性化部分質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,約7～10 d可見明顯的擴(kuò)增斑;待細(xì)胞30%～50%懸浮時(shí),收集細(xì)胞,反復(fù)凍融4次,收集病毒;經(jīng)過3輪擴(kuò)增,感染小鼠肝臟原代細(xì)胞 (圖2),感染效率達(dá)90%以上。48 h后收集肝原代細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)用抗Flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)感染Ad-CTGF的肝臟原代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量38000處有1條非常特異的帶,而感染Ad-GFP的對(duì)照則沒有條帶(圖 3)。

不同禁食條件下CTGF表達(dá)量變化情況 饑餓24 h和48 h后,CTGF表達(dá)量都是上升的,禁食后重新喂食CTGF的表達(dá)量又開始下降,這種變化情況與過氧化物酶體增值激活受體 γ共激活因子1 α(peroxisome proliferators-activated receptor γcoactivator 1 α,PGC1 α)變化情況類似;其中,饑餓48 h后CTGF和PGC1 α的表達(dá)量明顯高于進(jìn)食組 (P均 ＜0.05)(圖4)。

圖2 Ad-CTGF和Ad-GFP感染肝臟原代細(xì)胞48h的熒光照片 (×250)Fig 2 Fluorescence photos of mouse primary hepatocytes infected with Ad-CTGF and Ad-GFP(×250)

圖3 小鼠肝原代細(xì)胞感染 Ad-GFP和 Ad-CTGF 48 h后的Western blot驗(yàn)證表達(dá)Fig 3 Identification of the expression of CTGF in mouse primary hepatocyes infected with Ad-GFP and Ad-CTGF using the antibody of Flag-tag

圖4 不同禁食條件下PGC1 α和CTGF的表達(dá)情況Fig 4 Expressions of CTGF and PGC1 αunder different starving conditions

討 論

PGC1 α轉(zhuǎn)錄共激活子是肝臟饑餓代謝活動(dòng)的重要中介子,能夠在饑餓條件下,通過調(diào)控cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1轉(zhuǎn)錄共激活子2(cAMP responsive element binding protein 1 regulated transcription coactivator 2,CRTC2)應(yīng)答胰高血糖素/cAMP的誘導(dǎo)和維持糖異生基因的表達(dá)[9]。在肝原代水平上,過表達(dá)PGC1 α能夠模擬Fsk+Dex的作用。在喂食情況下,胰島素/蛋白激酶B (protein kinase,PKB)能夠通過多種途徑抑制PGC1 α的作用,AKT能夠直接磷酸化PGC1 α的 絲氨酸 -精氨 酸 (Serine-Arginine,SR) 結(jié)構(gòu)域里的S570[10]。此外,PGC1 α的SR結(jié)構(gòu)域能夠以胰島素/AKT依賴的方式與Foxo1相互作用。研究發(fā)現(xiàn),PGC1 α在糖脂代謝過程中有著重要的作用。轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC1 α在多種組織中可促進(jìn)線粒體生物合成及氧化代謝。禁食后,其在肝臟中被誘導(dǎo)表達(dá)并促進(jìn)糖異生、脂肪酸氧化;PGC1 α在褐色脂肪組織中被誘導(dǎo)表達(dá)以對(duì)抗低溫環(huán)境;機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí),其還能在骨骼肌中被誘導(dǎo)表達(dá)以促進(jìn)氧化磷酸化。本研究結(jié)果顯示,CTGF在禁食后表達(dá)量是上升的,與PGC1 α變化趨勢(shì)相同,并且變化明顯,提示CTGF可能參與了糖脂代謝。

腺病毒載體系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)基因在哺乳動(dòng)物和細(xì)胞中高效表達(dá),該實(shí)驗(yàn)方法目前應(yīng)用非常廣泛。本研究包裝成功的腺病毒感染肝原代細(xì)胞效率可以達(dá)到90%以上,為CTGF在細(xì)胞水平功能的研究提供了有力手段。而通過鼠尾靜脈注射高滴度的腺病毒,能夠特異且高效地感染肝臟細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)CTGF基因在肝臟中過表達(dá),同樣為CTGF的在肝臟中糖脂代謝功能的研究提供有力手段,并且為CTGF可能基因治療提供了保證。

[1]Tan JT,McLennan SV,Song WW,et al.Connective tissue growth factor inhibits adipocyte differentiation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2008,295(3):C740-C751.

[2]Rooney B,O'Donovan H,Gaffney A,et al.CTGF/CCN2 activates canonical Wnt signalling in mesangial cells through LRP6:Implications for the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].FEBS Lett,2011,585(3):531-538.

[3]Blalock TD,Yuan R,Lewin AS,et al.Hammerhead ribozyme targeting connective tissue growth factor mRNA blocks transforming growth factor-beta mediated cell proliferation[J].Exp Eye Res,2004,78(6):1127-1136.

[4]Croissandeau G,Chr étien M,Mbikay M.Involvement of matrix metalloproteinases in the adipose conversion of 3T3-L1 preadipocytes[J].Biochem J,2002,364(Pt3):739-746.

[5]Kim KH,Park GT,Lim YB,etal.Expression ofconnective tissue growth factor,a biomarker in senescence of human diploid fibroblasts,is upregulated by a transforming growth factor-β-mediated signalling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,318(4):819-825.

[6]Wang X,McLennan SV,Allen TJ,et al.Adverse effects of high glucose and free fatty acid on cardiomyocytes are mediated by connective tissue growth factor[J].Am J Physiol Cell Physiol,2009,297(6):C1490-C1500.

[7]Murphy M,Godson C,Cannon S,et al.Suppression subtractive hybridization identifies high glucose levels as a stimulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial cells[J].J BiolChem,1999,274(9):5830-5834.

[8]He Z,Way KJ,Arikawa E,et al.Differential regulation of angiotensin II-induced expression of connective tissue growth factor by protein kinase C isoforms in the myocardium[J].J Biol Chem,2005,280(16):15719-15726.

[9]Koo SH,Flechner L,Qi L,et al.The CREB coactivator TORC2 is a key regulator of fasting glucose metabolism[J].Nature,2005,437(7062):1109-1111.

[10]Claret M,Smith MA,Batterham RL,et al.AMPK is essential for energy homeostasis regulation and glucose sensing by POMC and AgRP neurons[J].J Clin Invest,2007,117(8):2325-2336.