大量制備過繼免疫治療用 γ δ T細胞時培養(yǎng)基的選擇

周建華,康 寧,崔蓮仙,何 維

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所免疫學系,北京 100005

治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)手段有手術(shù)治療、放射治療和化學治療。然而,手術(shù)治療不能清除腫瘤的微轉(zhuǎn)移灶,難以取得根治性療效;放療具有劑量依賴性毒性,無法有效清除潛在的轉(zhuǎn)移灶,且部分患者因產(chǎn)生放射抵抗而對放療不敏感;化療易引起全身免疫抑制,且部分患者因化療藥物無法有效進入腫瘤組織或?qū)熕幬锂a(chǎn)生耐藥性而影響療效。隨著對免疫學和腫瘤學研究的不斷深入,人們提出了生物治療的概念,其中過繼細胞免疫治療成為近年來免疫學研究的熱點[1]。γ δ T細胞能夠以主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)非限制性方式識別腫瘤抗原,通過穿孔素和顆粒酶等途徑殺傷腫瘤細胞,還與其他固有免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞相互作用,輔助其發(fā)揮抗腫瘤作用[2-4]。因此,γ δ T細胞在腫瘤免疫細胞治療中是一種具有優(yōu)勢的候選細胞[5-6]。為了有效擴增人外周血 γ δ T細胞以滿足臨床過繼免疫治療的需要,本研究在原有固相抗體體外擴增法的基礎(chǔ)上,進行了培養(yǎng)基的比較和選擇。

材料和方法

材料 人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心,使用添加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng);人外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離自健康志愿者外周血,樣本采集符合中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所倫理委員會的要求。淋巴細胞分離液購自天津TBD生物技術(shù)公司,重組人白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)購自北京瑞得合通藥業(yè)有限公司,佛波酯 (phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、離子霉素 Ionomycin為美國Sigma公司產(chǎn)品,布雷菲德菌素 (Brefeldin A,BFA)購自美國 eBioscience公司 ,純化抗人 TCR γ δ抗體、FITC 標記的抗人T細胞受體 (T cell receptor,TCR)γ δ單克隆抗體、PE標記的抗人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體、 CD107a抗體購自美國Biolegend公司,RPMI-1640培養(yǎng)基、AIM-V培養(yǎng)基和OpTmizer培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。Cyto-Tox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購自美國Promega公司,細胞內(nèi)染色的試劑盒Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Kit購自美國BD公司。RPMI-1640/AIM-V/OpTmizer完全培養(yǎng)基為含1%自體血清、200 U/ml IL-2、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基,細胞毒檢測用培養(yǎng)基為含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640。

人外周血來源 γ δ T細胞的培養(yǎng) 抗凝人外周血以淋巴細胞分離液分離,得到的PBMC分別重懸于RPMI-1640/AIM-V/OpTmizer無血清培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基 , 以 500μl(1μg/ml) 抗人 TCRγ δ單克隆抗體固相包被24孔培養(yǎng)板進行刺激,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2周。γ δ T細胞體外擴增效率的計算:

擴增效率 =(培養(yǎng)后細胞總數(shù) ×γ δ T細胞占細胞總數(shù)比例)/(PBMC總數(shù) ×γ δ T細胞占PBMC比例)

臺盼藍染色法檢測 γ δ T細胞的存活率 細胞用臺盼藍染色后,在顯微鏡下觀察,計數(shù)外周4個大格中總細胞數(shù)和著藍色的死細胞數(shù):

細胞存活率 =(總細胞數(shù)-死細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%

免疫熒光染色和流式細胞術(shù)檢測 γ δ T細胞的純度和表型 收集約1×106個細胞,以含1%BSA的PBS洗液洗滌2次。加入適量熒光標記抗體,4℃避光孵育20 min。PBS洗液洗滌 2次,重懸于200μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中,用于流式細胞儀分析。

免疫熒光染色和流式細胞術(shù)檢測 γ δ T細胞表達的殺傷相關(guān)分子和分泌的細胞因子 采用細胞毒檢測用培養(yǎng)基重懸 γ δ T細胞至1×106個細胞/ml,加入20 ng/ml PMA和 0.5μg/ml Ionomycin;如檢測細胞因子,需要同時加入3μg/ml BFA。將細胞置于37℃、5%CO2飽和濕環(huán)境孵育6 h;收集細胞,加入適量熒光標記抗體,4℃避光孵育20 min;PBS洗液洗滌2次,用300μl細胞膜固定透化液重懸細胞,4℃孵育30 min～1 h;透化洗液洗2次,加入適量熒光標記抗體,4℃避光孵育20 min;透化洗液洗滌細胞2次,重懸于200μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中,用于流式細胞儀分析。

乳酸脫氫酶法檢測 γ δ T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用 按照試劑盒說明書進行:收集腫瘤細胞Daudi作為靶細胞,以培養(yǎng)2周的人外周血來源 γ δ T細胞為效應(yīng)細胞 ,效靶比 (E∶T)分別為0.1∶1、0.5∶1、1∶1。效應(yīng)細胞和靶細胞混合后置于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集培養(yǎng)上清用于乳酸脫氫酶釋放量的測定。按照下列公式計算殺傷效率:

殺傷效率 =(實驗孔值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放孔值-靶細胞自發(fā)釋放孔值)/(靶細胞最大釋放孔值-靶細胞自發(fā)釋放孔值) ×100%

結(jié) 果

γ δ T細胞的存活率和純度比較 3種培養(yǎng)基添加自體血清培養(yǎng)的細胞存活率均略高于無血清培養(yǎng),其中RPMI-1640培養(yǎng)基添加血清與否對細胞的存活率影響最大,未添加血清的RPMI-1640培養(yǎng)基擴增的細胞存活率隨培養(yǎng)時間增加而下降 (圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細胞存活率的比較Fig 1 Comparison ofthe survival rate of γ δ T cells cultured in different culture media

6種培養(yǎng)條件下擴增達1周和2周時,除未添加自體血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和AMI-V培養(yǎng)基外,其余培養(yǎng)條件下 γ δ T細胞的純度都逐漸增加;不論添加血清與否,AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基擴增的細胞純度都明顯高于 RPMI-1640(P＜0.05或 P＜0.01)。第2周時,添加血清的 AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基擴增的細胞純度都顯著高于添加血清的RPMI-1640培養(yǎng)基 (P均 ＜0.05),但AIM-V和OpTmizer間差異沒有統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);未添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基擴增的細胞純度顯著高于RPMI-1640和AIM-V(P均 ＜0.05),添加血清與不添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞的純度在整個培養(yǎng)過程中差異均沒有統(tǒng)計學意義 (P均 ＞0.05)(圖2)。

γ δ T細胞擴增效率的比較 培養(yǎng)2周時,未添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞擴增效率顯著高于RPMI-1640和AIM-V(P均 ＜0.05);添加血清的AIM-V培養(yǎng)的細胞擴增效率顯著高于RPMI-1640(P＜0.05),而添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞擴增效率顯著高于RPMI-1640(P＜0.01)和AIM-V(P＜0.05);同種培養(yǎng)基添加血清培養(yǎng)時細胞的擴增效率均顯著高于不添加血清培養(yǎng)的細胞 (P＜0.05)(圖3)。

γ δ T細胞殺傷相關(guān)分子的表達及細胞因子的分泌 3種培養(yǎng)條件擴增的 γ δ T細胞經(jīng)PMA/Ionomycin刺激后,表達殺傷相關(guān)分子CD107a及分泌細胞因子TNF-α的細胞比例都明顯增加 (P＜0.01),3種培養(yǎng)條件擴增的細胞表達相同分子及分泌相同細胞因子的差異沒有統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(圖4)。

圖2 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細胞純度的比較Fig 2 Comparison of purity of γ δ T cells cultured in different culture media

圖3 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細胞擴增效率的比較Fig 3 Comparison of the proliferation of γ δ T cells cultured in different culture media

圖4 擴增 γ δ T細胞殺傷相關(guān)分子的表達及細胞因子的分泌Fig 4 Function-related molecule expression and cytokine release by expanded γ δ T cells

γ δ T細胞對腫瘤細胞的細胞毒作用比較 RPMI-1640培養(yǎng)的細胞對Daudi細胞的殺傷效率顯著低于OpTmizer和AIM-V培養(yǎng)的細胞 (P均 ＜0.05),OpT-mizer和AIM-V培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞對Daudi細胞的殺傷效率差異沒有統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(圖5)。

圖5 擴增 γ δ T細胞對腫瘤細胞Daudi的細胞毒作用Fig 5 Cytotoxicity against Daudi cells by expanded γ δ T cells

討 論

在人類外周血中, γ δ T細胞約占CD3+T細胞的1%～10%。根據(jù)其表達V γ和Vδ功能區(qū)的不同,可將人類 γ δ T細胞分為不同亞群,其中外周血主要包含兩個亞群:(1)Vδ 2 T細胞:表達 TCR可變區(qū)V γ 9 和 V δ 2 的細胞 亞群 , 在 外 周血 γ δ T 細胞中所占比例較高;(2)Vδ 1 T細胞:表達TCR可變區(qū) Vδ l的細胞亞群,主要定居于上皮組織中,在外周血 γ δ T細胞中所占比例較低[7]。盡管一直以來,大家都認為V δ 2 T細胞主要分布于外周血,對血液系統(tǒng)腫瘤有較好的細胞毒作用,而Vδ 1 T細胞主要分布于上皮組織及上皮相關(guān)的淋巴組織中,對上皮來源腫瘤細胞有較好的細胞毒作用[5],但是,越來越多的證據(jù)顯示,V δ 1 T細胞在抗血液系統(tǒng)腫瘤的過程中同樣具有舉足輕重的作用[8]。

目前國際上用于過繼免疫治療的 γ δ T細胞主要來自磷酸抗原的體外擴增,該方法擴增的主要是V δ 2 亞型的 γ δ T 細胞[9]。 本課題 組前期 研究證實 ,采用固相化抗 TCRγ δ單克隆抗體擴增法可以使 γ δ T細胞得到大量擴增,擴增的 γ δ T細胞既包括 Vδ 2亞群,也包括Vδ 1亞群,并對多種腫瘤細胞有明顯細胞毒作用[10]。這為固相化抗TCR γ δ單克隆抗體擴增的 γ δ T細胞用于過繼免疫治療腫瘤提供了研究基礎(chǔ)。

為了使 γ δ T細胞的培養(yǎng)更簡便 、更適合臨床過繼免疫治療的應(yīng)用,本研究采用了RPMI-1640、AIM-V和OpTmizer 3種培養(yǎng)基,其中,RPMI-1640是培養(yǎng)T細胞最常用的培養(yǎng)基,培養(yǎng)過程中需要添加一定比例的血清,以補充細胞生長所需的一些未知的細胞因子,而常用作添加的牛血清因為是異種血清不能在臨床治療時使用。人AB血清或者自體血清可以作為牛血清的替代品,但是因為其來源有限而限制了細胞制劑的規(guī)模化生產(chǎn)。為此,對血清依賴性低的培養(yǎng)基成為臨床治療用細胞培養(yǎng)的首選。同樣廣泛應(yīng)用于T細胞培養(yǎng)的AIM-V培養(yǎng)基被稱為無血清培養(yǎng)基,而OpTmizer培養(yǎng)基是在AIM-V的基礎(chǔ)上進行改良的新型無血清培養(yǎng)基,內(nèi)含可以提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平[11]的N-乙酰-1-半胱氨酸,有利于細胞因子依賴的T細胞擴增[12]。本研究比較了3種培養(yǎng)基分別在添加或不添加自體血清條件下對 γ δ T細胞的擴增能力,以及所擴增的 γ δ T細胞的效應(yīng)功能。結(jié)果顯示,不添加血清的條件下,AIM-V和OpTmizer對 γ δ T細胞的擴增能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的RP-MI-1640培養(yǎng)基。添加1%自體血清后,3種培養(yǎng)基的擴增效果都明顯增強,但AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基仍然具有明顯優(yōu)勢,特別是OpTmizer培養(yǎng)基擴增γ δ T細胞的能力最佳,且對腫瘤細胞具有良好的細胞毒活性。這些結(jié)果表明,OpTmizer培養(yǎng)基對血清依賴性最低,擴增的細胞具有良好的效應(yīng)功能,更適合臨床治療所需 γ δ T細胞制劑的大規(guī)模制備。

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