細(xì)胞外信號(hào)激酶蛋白5在卵泡刺激素介導(dǎo)的卵泡顆粒細(xì)胞甾體激素生成中的作用

高小博,姚 楠,馬 旭,陸彩玲,楊伯清,彭小忠

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100005

2國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳室,北京 100081

3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)信息研究所基層衛(wèi)生與婦幼保健研究室,北京 100020

卵泡是卵巢的基本組成單位,由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞組成。顆粒細(xì)胞隨卵泡的發(fā)育而增殖和分化,在垂體分泌的促性腺激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黃體生成素(luteotropic hormone,LH)刺激下,顆粒細(xì)胞可產(chǎn)生甾體激素雌激素和孕酮,對(duì)卵泡發(fā)育和懷孕等生殖功能發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[1]。甾體激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白StAR參與甾體激素的前體膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn),是甾體激素生物合成的必經(jīng)途徑[2-3]。促性腺激素主要通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶引起細(xì)胞cAMP增加和激酶A(protein kinase A,PKA)激活,隨后激活一系列信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)甾體激素生成基因的表達(dá)。有研究表明,細(xì)胞外信號(hào)激酶蛋白1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)等經(jīng)典MAPK通路參與了促性腺激素介導(dǎo)的甾體激素生成[4-6]。細(xì)胞外信號(hào)激酶蛋白5(extracellular signal-regulated protein kinase 5,ERK5)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的MAPK家族成員[7-8],本研究探討了ERK5在顆粒細(xì)胞甾體激素生成過(guò)程中的作用。

材料和方法

材料 出生23 d的雌性SD大鼠,體重40～45 g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;孕馬血清促性腺激素 (pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)干粉購(gòu)自北京海德創(chuàng)業(yè)生物公司,DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,ERK5和StAR抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,ERK5特異性磷酸化抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司,β-actin抗體、FSH、碘化丙啶 (propidiumiodide,PI)、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司,蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche公司,Bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司,ECL檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司,辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司,組成型活性腺病毒MEK5[Ad-MEK5(ca)]、野生型腺病毒ERK5[Ad-ERK5(wt)]、顯性負(fù)效應(yīng)腺病毒ERK5[Ad-ERK5(dn)]和綠色熒光蛋白腺病毒Ad-GFP購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司。

原代顆粒細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 將23 d齡SD大鼠經(jīng)腹腔注射400μl PMSG注射液 (20U/只)刺激卵泡發(fā)育,48 h后脫臼處死;取雙側(cè)卵巢,置于含5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中,修剪卵巢周圍組織,清洗3次;體式顯微鏡下用小號(hào)針頭刺破卵泡,釋放顆粒細(xì)胞;1000 r/min(r=18.6 cm)離心10 min后,棄去上清,以含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,稀釋至5×105個(gè)/ml,分裝入培養(yǎng)板培養(yǎng),24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況;細(xì)胞換成無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜后加入含有FSH (50 ng/ml)的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基,分別處理0、6、12、24、48 h后收集細(xì)胞行Western blot檢測(cè)。

Western blot檢測(cè) 通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞,PBS清洗后用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液[10 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)+150 mmol/L NaCl+1 mmol/L EDTA(pH8.0)+1%Triton X-100+0.5%脫氧膽酸鈉 +0.1%SDS+10 mmol/L氟化鈉 +0.2 mmol/L礬酸鈉]裂解細(xì)胞,收集蛋白并利用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。將50～100μg蛋白用12%SDSPAGE膠分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,分別利用抗ERK5、ERKS特異性磷酸化抗體、抗StAR抗體以及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交,通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色,并以 β-actin抗體雜交作為內(nèi)對(duì)照。

免疫熒光共聚焦 將顆粒細(xì)胞在共聚焦專用培養(yǎng)皿中培養(yǎng),經(jīng)過(guò)FSH處理后,用4%多聚甲醛固定30 min,在室溫下以含0.5%Triton X-100的PBS通透細(xì)胞10 min;隨后細(xì)胞用含1%BSA的PBS室溫封閉1 h,用PBS以1∶30的稀釋比加入ERK5抗體,4℃孵育過(guò)夜,用PBS 1∶50稀釋的 FITC標(biāo)記二抗,37 ℃孵育 30 min;用 10μg/ml的碘化丙啶染核,37℃孵育20 min;室溫避光晾干,抗猝滅封片劑封片,避光保存。用激光共聚焦顯微鏡 (Zeiss LSM 510 META,德國(guó)Zeiss公司)觀察,每次觀察時(shí)的設(shè)置參數(shù)保持一致。

腺病毒感染 原代顆粒細(xì)胞分離后在含有15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜,12 h后用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2～3次,洗去未貼壁的細(xì)胞。每個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中加入1.5 ml不加抗生素的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,分別采用Ad-MEK5(ca)(含人MEK5的組成性激活形式,感染顆粒細(xì)胞后能夠使細(xì)胞中MEK5活化形式增加)、Ad-ERK5(wt)(含人ERK5,感染顆粒細(xì)胞后能夠使細(xì)胞中ERK5的總體表達(dá)水平增加)和Ad-ERK5(dn)(含人ERK5的顯性陰性形式,感染顆粒細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大量有正常結(jié)合位點(diǎn)而功能位點(diǎn)突變失活的ERK5)3種重組腺病毒,以3×1011顆粒/ml濃度感染顆粒細(xì)胞5 h;隨后將培養(yǎng)基換為無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用含有FSH(50ng/ml)的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基處理感染后的顆粒細(xì)胞,12 h后收集上清檢測(cè)孕酮含量,收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

放射免疫法測(cè)定孕酮 24孔板每孔中加入約5×105個(gè)顆粒細(xì)胞 ,用500μl含15%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),然后用各種試劑進(jìn)行處理。當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后,收集培養(yǎng)基利用放射免疫法測(cè)定孕酮含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件和R統(tǒng)計(jì)分析平臺(tái),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);兩組以上均數(shù)的比較首先采用單因素方差分析,然后采用Student-Newman-Keuls進(jìn)行兩兩均數(shù)間的比較;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

FSH對(duì)ERK5表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,用50 ng/ml的FSH處理顆粒細(xì)胞后,ERK5的表達(dá)量隨著FSH處理時(shí)間增加而逐漸下降,而ERK5活性形式的表達(dá)量則隨著FSH處理時(shí)間增加而逐漸上升 (圖1)。

圖1 FSH對(duì)顆粒細(xì)胞ERK5及ERK5活性形式表達(dá)的影響Fig 1 Effect of FSH on ERK5 protein levels and phospho-ERK5 protein levels in granulosa cells

FSH對(duì)ERK5在顆粒細(xì)胞中亞細(xì)胞分布的影響激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察結(jié)果顯示,ERK5主要分布于顆粒細(xì)胞的胞漿中,經(jīng)FSH處理后,ERK5蛋白定位沒(méi)有發(fā)生明顯變化 (圖2)。

圖2 FSH(50ng/ml)處理后ERK5在顆粒細(xì)胞的亞細(xì)胞分布Fig 2 Effect of follicle-stimulating hormone(50ng/ml)on the subcellular distribution of ERK5 in granulosa cells

ERK5活化對(duì)FSH介導(dǎo)顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響經(jīng)FSH(50 ng/ml)處理12 h后,Ad-MEK5(ca)和Ad-ERK5(wt)聯(lián)合感染組顆粒細(xì)胞的孕酮分泌水平及細(xì)胞內(nèi)StAR表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和Ad-GFP感染組 (P均 ＜0.05)。Ad-ERK5(dn)感染組顆粒細(xì)胞的孕酮分泌水平明顯低于Ad-GFP感染組 (P＜0.05),與空白對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.051);細(xì)胞StAR表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和Ad-GFP感染組 (P均 ＜0.05)(圖3)。

討 論

圖3 FSH和腺病毒處理后各組顆粒細(xì)胞孕酮分泌水平及細(xì)胞內(nèi)StAR表達(dá)水平Fig 3 Progesterone and StAR protein in granulosa cells after having been exposed to follicle-stimulating hormone and recombinant adenoviruses

絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用,可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等各種細(xì)胞功能,常見(jiàn)的MAPK家族成員有ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK,ERK5是近年發(fā)現(xiàn)的MAPK家族新成員[9]。ERK5與 ERK1/2有53%的同源性,其N-末端含有1個(gè)高度保守的雙磷酸化位點(diǎn) (Thr219,Tyr221),是激酶活化域,現(xiàn)已證明雙磷酸化此位點(diǎn)能激活 ERK5[7-8]。1995年,Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn),ERK5能通過(guò)其上游激酶MEK5被氧化物刺激及滲透壓改變所激活。此后不斷有研究證實(shí)ERK5能夠被某些生長(zhǎng)因子激活,如:上皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和纖維生長(zhǎng)因子-2等[10-12]。FSH是由垂體釋放的一類對(duì)女性生殖功能有重要作用的激素,調(diào)節(jié)了卵泡的正常發(fā)育直至引發(fā)排卵。本研究結(jié)果顯示,FSH處理顆粒細(xì)胞后,ERK5的表達(dá)量隨FSH處理時(shí)間增加而逐漸下降,而ERK5活性形式的表達(dá)量則隨FSH處理時(shí)間的增加而逐漸上升,提示顆粒細(xì)胞中ERK5的表達(dá)可能受到FSH的復(fù)雜調(diào)控。

MAPK屬于蛋白絲/蘇氨酸激酶,MAPK一般可通過(guò)接受膜受體轉(zhuǎn)換與傳遞的信號(hào)將其傳遞至細(xì)胞漿中的下游激酶或細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用。根據(jù)細(xì)胞類型不同,ERK5在細(xì)胞中的分布也不相同,內(nèi)源性ERK5可能分布于細(xì)胞漿,也可能遍布細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。本研究發(fā)現(xiàn),顆粒細(xì)胞的內(nèi)源性ERK5主要定位于細(xì)胞漿中,被FSH刺激后并沒(méi)有表現(xiàn)明顯的亞細(xì)胞定位的變化,而神經(jīng)元細(xì)胞被腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子刺激后ERK5可從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核[13],可見(jiàn)在不同的條件下,ERK5的空間分布受到不同調(diào)控。結(jié)合FSH刺激顆粒細(xì)胞后ERK5總體表達(dá)和活性形式表達(dá)趨勢(shì)相反的情況可以看出,在FSH作用于顆粒細(xì)胞的過(guò)程中,ERK5發(fā)揮著極其復(fù)雜的生物學(xué)作用。FSH刺激甾體激素的生成需要FSH激活顆粒細(xì)胞上的FSH受體偶聯(lián)的G蛋白,使激素敏感的腺苷酸環(huán)化酶活化,引起細(xì)胞內(nèi)cAMP升高,進(jìn)而激活下游PKA信號(hào)通路,從而觸發(fā)各相關(guān)信號(hào)通路例如ERK1/2、p38MAPK等的活化以調(diào)節(jié)與甾體激素生成相關(guān)基因的表達(dá)[5,14-15]。在顆粒細(xì)胞中ERK5是否受到FSH刺激的cAMP/PKA通路和MEK5的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

ERK5的激活與細(xì)胞生存、增殖及分化等多種生物學(xué)行為有關(guān)。研究表明,ERK5在心臟和神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[16-17]。在FSH刺激顆粒細(xì)胞分泌類固醇激素的過(guò)程中,MAPK家族的其他成員,如:p38MAPK和ERK1/2均被發(fā)現(xiàn)與該生理過(guò)程有關(guān),本研究也發(fā)現(xiàn)ERK5參與了FSH引起的顆粒細(xì)胞生成甾體激素。本研究采用重組腺病毒感染原代顆粒細(xì)胞,結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)ERK5被大量激活后FSH引起的孕酮分泌和細(xì)胞內(nèi)StAR的表達(dá)都升高,而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ERK5活性被抑制后則出現(xiàn)相反的效應(yīng),這一結(jié)果說(shuō)明ERK5的活化在FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞分泌甾體激素過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。但是值得注意的是,與ERK1/2和p38MAPK稍有不同,FSH對(duì)ERK5的激活效應(yīng)在48h達(dá)到頂峰,而FSH對(duì)ERK1/2和p38MAPK的效應(yīng)則要迅速的多,分別在FSH處理20min和30min后達(dá)到頂峰[15,18]。這一現(xiàn)象提示ERK5在上述生理過(guò)程中可能發(fā)揮著與ERK1/2或p38MAPK不同的作用,這種作用更可能調(diào)控較為晚期的生物學(xué)效應(yīng)。

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