表皮生長(zhǎng)因子影響人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的機(jī)制

李彩虹,施 萍,龐希寧

中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1細(xì)胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室2附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)教研室,沈陽 110001

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 (human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)在羊膜中含量豐富,分化能力強(qiáng),能在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng),且生物性能穩(wěn)定,可以為實(shí)驗(yàn)和臨床提供充足的細(xì)胞來源。表皮生長(zhǎng)因子 (epidermal growth factor,EGF)可與EGF受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合并激活EGFR信號(hào)通路,在促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、遷移等方面發(fā)揮重要作用[1]。筆者以往研究發(fā)現(xiàn),EGF能促進(jìn)hAMSCs的增殖和遷移[2]。

研究顯示,磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)家族參與了多種信號(hào)通路,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控降低或促進(jìn)其表達(dá),可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)。Jak/STAT和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases,ERK)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡,對(duì)腸道病理生理過程起著重要的調(diào)控作用[3-5]。Sheng等[6]研究證實(shí),ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、分化和凋亡中均發(fā)揮十分重要的作用。在多種病理生理過程中,PI3K/AKT和ERK通路之間可產(chǎn)生多樣的相互作用[7-8],兩者可協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡等病理生理過程[9-10]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)是降解細(xì)胞外基質(zhì)骨架蛋白Ⅳ型膠原的主要酶之一,主要參與傷口愈合等生理功能,在正常成人組織中水平較低,只有在系統(tǒng)接受一個(gè)刺激或病理狀態(tài)下才會(huì)升高。研究表明,腫瘤細(xì)胞侵襲過程中首先需要水解細(xì)胞外基質(zhì),多種腫瘤細(xì)胞的侵襲均伴隨MMP-2表達(dá)升高,EGF促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞遷移時(shí),MMP-2表達(dá)也有升高[11]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是基因功能研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn),通過在整體水平研究基因的表達(dá),揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程的分子機(jī)制,是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組功能信息的必然紐帶[12]。目前關(guān)于細(xì)胞遷移機(jī)制的研究主要集中在具體某條信號(hào)通路上,缺少整體水平的研究。本研究觀察了EGF對(duì)體外培養(yǎng)hAMSCs遷移的影響,并在轉(zhuǎn)錄組水平上檢測(cè)了基因表達(dá)的差異,探討了EGF影響hAMSCs遷移的機(jī)制。

材料和方法

材料 DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司,FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司,EGF、AG1478、LY294002、U0126購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,磷酸化表皮生長(zhǎng)因子 (phosphorylated Epidermal growth factor,P-EGFR)、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,P-AKT)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (phosphorylated extracellular regulated protein kinases,P-ERK1/2)、MMP-2 抗體購(gòu)自美國(guó)Cellsignaling公司,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購(gòu)自中國(guó)Kangchen公司,山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,RTPCR試劑盒、Realtime-PCR試劑盒購(gòu)自大連Takara公司。

hAMSCs遷移能力的測(cè)定 采用帶有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的遷移能力,具體為:hAMSCs用無血清的DMEM/F12饑餓12 h,胰酶消化并用無血清培養(yǎng)基制成密度為2×105/ml的細(xì)胞懸液,然后分為對(duì)照組 (未處理)、EGF組、抑制劑AG1478+EGF組、抑制劑LY294002+EGF組和抑制劑U0126+EGF組5組;將100μl細(xì)胞懸液分別加入各孔上室,下室加入600μl含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基;培養(yǎng)24 h后取出小室,以棉簽拭去小室濾膜上的細(xì)胞,小室濾膜下的細(xì)胞于4%多聚甲醛中固定10 min,DAPI染色。由于DAPI能將細(xì)胞核染成藍(lán)色,1個(gè)細(xì)胞只有1個(gè)細(xì)胞核,所以通過計(jì)數(shù)藍(lán)色的細(xì)胞核數(shù)目就可以得到穿過膜的細(xì)胞數(shù)。在熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目,取平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Western blot 取等量細(xì)胞總蛋白,用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用TBST[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6),150 mmol/L NaCl,0.05%Tween-20]洗3次,然后用5%的脫脂奶粉封閉1 h,一抗雜交過夜,TBST洗3次,再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗雜交1 h,TBST洗3次,最后用ECL plus(GE Healthcare)檢測(cè)。

Real-time PCR 采用ABI Prism 7500(美國(guó)ABI公司),用SYBR Green法進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品做3個(gè)副孔,以GAPDH做對(duì)照,具體為:用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用特異性引物做q-PCR,檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物采用Primer 5設(shè)計(jì),GAPDH上游引物5'-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC,下游引物5'-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A;MMP-2上游引物5'-CTC ATC GCA GAT GCC TGG AA,下游引物5'-CAG CCT AGC CAG TCG GAT TTG。

RNA-Seq技術(shù) 提取生物樣品的總 RNA,從中純化出mRNA;利用二價(jià)陽離子處理mRNA使其片段化,然后將片段化的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,構(gòu)成cDNA文庫(kù),并用高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增以富集所得到的cDNA文庫(kù);利用Illumina Genome Analyzer平臺(tái)對(duì)得到的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)處理及后續(xù)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各組hAMSCs的遷移情況 對(duì)照組、EGF組、抑制劑AG1478+EGF組、抑制劑LY294002+EGF組和抑制劑U0126+EGF組穿過的細(xì)胞數(shù)目分別為41.13 ±2.862、60.33 ±5.482、35.73 ±0.8110、37.40±1.943和40.97±1.977,其中,EGF組是對(duì)照組的1.5倍 (P=0.0361),抑制劑AG1478+EGF組 (P=0.0113)、抑制劑 LY294002+EGF組 (P=0.0169)和抑制劑 U0126+EGF組 (P=0.0293)明顯低于對(duì)照組。

各組P-EGFR、P-AKT和P-ERK1/2的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,EGF處理10 min后,EGF組的P-EGFR、P-AKT和 P-ERK1/2表達(dá)水平增加;60 min后,P-EGFR恢復(fù)至原來的水平,P-AKT和P-ERK1/2仍低于原來的水平。抑制劑AG1478+EGF組的P-EGFR表達(dá)未見升高、P-AKT和P-ERK1/2表達(dá)也未升高。抑制劑LY294002+EGF組的P-AKT表達(dá)水平顯著下降,P-ERK表達(dá)水平較EGF組有所降低,但較對(duì)照組有所升高。抑制劑U0126+EGF組的P-ERK1/2顯著降低 (圖1)。

EGF作用后MMP-2的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,EGF作用24 h后,MMP-2蛋白表達(dá)水平升高,MMP-9表達(dá)沒有變化。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果,EGF處理12 h后,MMP-2 mRNA表達(dá)水平增高,之后下降 (圖2)。

差異表達(dá)基因的篩選情況 對(duì)EGF組和對(duì)照組細(xì)胞中差異表達(dá)基因的GO功能富集分析和KEGG代謝途徑分析結(jié)果表明,EGF組細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾、凋亡抑制等生命過程,其中與MAPK信號(hào)通路有關(guān)的基因?yàn)镈USP5、IL1B、DUSP6、NGF和HSPA2。

討 論

圖1 各組P-EGFR、P-AKT和P-ERK1/2的表達(dá)情況Fig 1 Expressions of P-EGFR,P-AKT,and P-ERK1/2 in each group

圖2 EGF作用不同時(shí)間后MMP-2和MMP-9的變化情況Fig 2 Expressions of MMP-2 and MMP-9 after having been treated with EGF for different time

為了評(píng)估EGF作用于hAMSCs后對(duì)其遷移的影響以及其中可能涉及的信號(hào)通路,本研究首先采用Transwell小室檢測(cè)了不同處理?xiàng)l件下hAMSCs的遷移情況,此外還檢測(cè)了EGFR、AKT、ERK等信號(hào)分子的磷酸化水平,并采用AG1478、LY294002、U0126等一系列信號(hào)分子的抑制劑來進(jìn)一步驗(yàn)證各信號(hào)分子的活性受到抑制后對(duì)EGF作用所產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示EGF處理后hAMSCs遷移能力增強(qiáng),并且PI3K/AKT通路中的AKT磷酸化水和ERK信號(hào)通路中的ERK1/2磷酸化水平增高。用EGFR的抑制劑AG1478作用后,EGFR、AKT、ERK1/2的磷酸化水平均下降;PI3K的抑制劑LY294002作用后,AKT和ERK1/2的磷酸化水平下降,細(xì)胞的遷移能力也下降。由此推測(cè),EGF與EGFR構(gòu)成的信號(hào)通路可能是經(jīng)過PI3K、ERK等信號(hào)分子,進(jìn)一步將遷移信號(hào)傳導(dǎo)致核內(nèi),引起基因轉(zhuǎn)錄,編碼細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞骨架變化所必需的蛋白質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞的遷移。

研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶,特別是MMP-2和MMP-9可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)使得細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞間的連接降解,從而參與內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移[13]。干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞一樣,具有分化程度低的特點(diǎn),兩者在一些基因調(diào)節(jié)方面也有相似之處。有研究證實(shí),MMP-2的過表達(dá)與腫瘤侵襲程度密切相關(guān),小鼠胚胎干細(xì)胞中可表達(dá)MMP-2和MMP-9,但其表達(dá)是否與細(xì)胞的遷移有關(guān)目前尚不清楚[11]。本研究檢測(cè)了EGF作用不同時(shí)間后MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)MMP-2在EGF作用24 h后顯著升高,MMP-9表達(dá)沒有變化;之后用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)EGF作用后MMP-2在mRNA水平的表達(dá),發(fā)現(xiàn)EGF作用12 h后MMP-2表達(dá)增高;由此推測(cè)MMP-2可能參與了EGF對(duì)hAMSCs的調(diào)控,與細(xì)胞遷移有關(guān)。

鑒于單獨(dú)研究某條信號(hào)通路的局限性,本研究采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)hAMSCs基因組、基因匹配情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,并對(duì)EGF組和對(duì)照組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果顯示EGF組細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾、抑制凋亡等生命過程,與MAPK信號(hào)通路有關(guān)的基因?yàn)镈USP5、IL1B、DUSP6、NGF和HSPA2。其中,DUSP5是一種雙特異性蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶,酪氨酸磷酸化在控制正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞-細(xì)胞通信、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道、免疫應(yīng)答及生存方面非常重要,因此DUSP5基因有望成為調(diào)節(jié)hAMSCs遷移的靶點(diǎn)。

綜上,本研究結(jié)果顯示,EGF可以促進(jìn)體外培養(yǎng)hAMSCs的遷移,其可能是通過PI3K/AKT、ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的,需要MMP-2的表達(dá),及其參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾和凋亡抑制等基因的協(xié)同表達(dá)。由于EGF在干細(xì)胞治療過程中可能通過促進(jìn)有絲分裂、新生血管生成、抗炎、細(xì)胞保護(hù)、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫等旁分泌機(jī)制來發(fā)揮作用[14],因此可望在hAMSCs的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

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