H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗安全性試驗(yàn)研究

劉芳萍，羅鵬志，李昌文，王牟平，智海東，劉景利，佟恒敏，劉艷艷，盧斯亮，陳雪英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001）

禽流感 (Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種禽類急性傳染病。根據(jù)AIV對(duì)易感雞致病性的差異，可將AIV分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。近年來(lái)，高致病性H5N1亞型禽流感在世界上許多國(guó)家暴發(fā)流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，由于禽流感病毒具有感染人的能力，也給人類的身體健康造成巨大的威脅[1]。目前，臨床上對(duì)禽流感的防控主要是采用禽流感油佐劑滅活疫苗，以預(yù)防為主。

當(dāng)今疫苗的安全性，特別是重大動(dòng)物疫病疫苗的安全性已成為人們關(guān)注焦點(diǎn)[2]。油佐劑滅活疫苗以其安全、免疫效力高、免疫持續(xù)期長(zhǎng)等特點(diǎn)，已成為預(yù)防動(dòng)物傳染病不可缺少的免疫制劑，其安全性問題同樣不容忽視[3-4]。以往在評(píng)價(jià)疫苗的安全性試驗(yàn)中，一般以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)病作為疫苗是否安全的標(biāo)準(zhǔn)，這種評(píng)價(jià)方法帶有一定的局限性[5]。為了評(píng)價(jià)H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗使用的安全性，本文對(duì)其急性毒性、眼結(jié)膜刺激性、肌肉刺激性及溶血性進(jìn)行試驗(yàn)研究，從而為臨床安全、合理使用疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大耳白兔，雄性，1.8～2.3 kg，購(gòu)自哈爾濱漢方實(shí)驗(yàn)鼠類養(yǎng)殖所。

AA+肉雞，雌雄各半，購(gòu)自哈爾濱振明養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)藥品

H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗佐劑，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

取7日齡AA+肉雞70只，隨機(jī)分成7組，每組10只，雌雄各半，1～6組為試驗(yàn)組（分別為高劑量疫苗組與佐劑組、中劑量疫苗組與佐劑組、低劑量疫苗組與佐劑組），第7組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)前禁食14 h，不禁水，以雞能承受的最大給藥濃度和最大給藥容積，采取頸背部皮下給藥。具體給藥劑量見表1。

表1 急性毒性試驗(yàn)給藥劑量Table 1 Dose of acute toxicity experiment

常規(guī)飼養(yǎng)14 d，觀察雞的精神狀態(tài)、中毒時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)狀況。每組隨機(jī)取2只雞斷頭處死，觀察體腔積液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胃腸等的變化。由于給藥體積非常大，已超出雞正常生理代償能力時(shí)，雞仍未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡，無(wú)法測(cè)得該疫苗的半數(shù)致死量LD50，故而進(jìn)行最大給藥量測(cè)定試驗(yàn)。

取7日齡AA+肉雞30只，雌雄各半。試驗(yàn)前禁食14 h，不禁水，采取頸背部皮下給藥，以最大給藥濃度和雞能承受的最大給藥容積，于1 d內(nèi)間隔6 h兩次注射疫苗和佐劑。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)7 d，逐日觀察雞的外觀、精神狀態(tài)、飲食、睡眠、活動(dòng)狀況及死亡數(shù)。

1.4 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)

取健康兔12只，采用自身對(duì)照法，分為兩組，每組6只。第一組，每只兔左眼滴加疫苗2滴，右眼滴加生理鹽水2滴。第二組，每只兔左眼滴加佐劑2滴，右眼滴加生理鹽水2滴，觀察兔眼的情況。給藥后，使兔眼被動(dòng)閉合5～10 s，讓藥液和眼充分接觸，2 min后立即用生理鹽水沖洗眼睛至眼中無(wú)任何異物，隨后觀察兔眼的情況1.5～3 h。進(jìn)行受試物對(duì)眼刺激性評(píng)分，并計(jì)算積分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為無(wú)刺激性(0～3分)、輕度刺激性(4～8分)、中度刺激性(9～12 分)和強(qiáng)刺激性(13～16 分)4 個(gè)等級(jí)[6]。

1.5 肌肉刺激試驗(yàn)

取健康兔8只，采用自身對(duì)照，分為兩組，每組4只。第一組左側(cè)股四頭肌注射疫苗1 mL，右側(cè)注射生理鹽1 mL。第二組，左側(cè)股四頭肌注射佐劑1 mL，右側(cè)注射生理鹽1 mL。注射后正常飼養(yǎng)，48 h后將兔處死，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織有無(wú)刺激現(xiàn)象（充血、水腫、硬結(jié)、變性或壞死）。進(jìn)行受試物對(duì)肌肉刺激性評(píng)分。結(jié)果判斷：平均反應(yīng)分值在2級(jí)及以下者，可認(rèn)為符合規(guī)定；大于2級(jí)者則認(rèn)為不符合規(guī)定，不供肌肉注射或靜脈注射[7]。

1.6 溶血試驗(yàn)

取健康兔1只，自心臟采血5 mL，用生理鹽水稀釋成2%的混懸液。按表2加入2%的紅細(xì)胞混懸液、生理鹽水、蒸餾水和疫苗，混勻后，置37℃恒溫箱中。開始每隔30 min觀察1次，2次后，每隔1 h觀察1次，觀察4 h。結(jié)果判斷：陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照管發(fā)生溶血。若供試品管中的溶液在3 h內(nèi)不發(fā)生溶血和凝聚，供試品則可用于注射；若供試品管中的溶液在3 h內(nèi)發(fā)生溶血和（或）凝聚，則供試品不宜用于注射[8]。

表2 溶血試驗(yàn)反應(yīng)Table 2 Reaction of hemolysis test (mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

給藥后14 d內(nèi)，各給藥劑量組雞除第一天給藥后有點(diǎn)不適，活動(dòng)減少外，未見發(fā)生中毒癥狀和死亡。每組隨機(jī)取2只雞，斷頭處死后病理學(xué)剖檢，肉眼觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胃腸等主要臟器，未出現(xiàn)眼觀病理變化。由于給藥容積已超出雞正常生理代償能力，雞仍未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡，所以不能精確計(jì)算該疫苗的LD50，故進(jìn)行最大給藥量測(cè)定試驗(yàn)。

一日內(nèi)最大給藥量的測(cè)定試驗(yàn)中，第一次注射完20倍臨床劑量的疫苗或佐劑后，進(jìn)行第二次注射時(shí)，藥物已無(wú)法繼續(xù)進(jìn)入體內(nèi)，限于給藥農(nóng)度和給藥容積，因此，確定H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗最大給藥量為其臨床使用劑量的20倍。

2.2 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)

眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可見，疫苗組和佐劑組試驗(yàn)兔眼，均出現(xiàn)虹膜輕度充血、腫脹，瞳孔仍對(duì)光有反應(yīng)，結(jié)膜充血，呈鮮紅色，眼瞼伴有輕微水腫。兩生理鹽水對(duì)照組兔眼均無(wú)異常反應(yīng)。表明疫苗對(duì)眼睛有輕度的刺激性，且該刺激性主要源于佐劑。

表3 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of eye irritation test

2.3 肌肉刺激性試驗(yàn)

結(jié)果見圖1。

圖1 注射藥物后肌肉解剖Fig.1 Muscle anatomy after drug injection

經(jīng)肌肉注射給藥后，兩組兔健康，腿部活動(dòng)正常。剖檢可見，兩組試驗(yàn)兔左腿和右腿在注射部位均未出現(xiàn)肌肉變性或壞死，僅在左腿針眼處均有相同程度的輕微充血，在注射部位附近肌肉上殘留有少量白色干酪物，如圖1所示。各組反應(yīng)級(jí)別之和均為2。結(jié)果表明，該疫苗的佐劑吸收性相對(duì)較差，在注射部位還殘留有少量的干酪物，引起給藥部位輕度充血。

2.4 溶血試驗(yàn)

結(jié)果見表4?？芍?，7號(hào)試管（陽(yáng)性對(duì)照管）在0.5 h內(nèi)就發(fā)生完全溶血，溶液澄明紅色，管底無(wú)細(xì)胞殘留；其余6管上清液無(wú)色澄明，紅細(xì)胞全部下沉，在4 h內(nèi)均未出現(xiàn)溶血和凝集反應(yīng)。結(jié)果表明，該疫苗無(wú)溶血性，符合注射劑的要求。

表4 溶血性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of hemolysis test

3 討論與結(jié)論

疫苗接種的不良反應(yīng)越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注，因?yàn)橐呙缃臃N也會(huì)發(fā)生除正常免疫反應(yīng)以外的不利于機(jī)體的不良反應(yīng)，因此在研究疫苗效果的同時(shí)，對(duì)其安全性的評(píng)估也不容忽視。H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗以油包水的形式存在，疫苗經(jīng)機(jī)體降解與吸收后逐漸緩慢釋放抗原，起到了抗原庫(kù)的作用，刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平較高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，一次接種可獲得較好的免疫力等優(yōu)點(diǎn)。但是，油佐劑疫苗的制造過程中可能由于抗原的制造，或疫苗佐劑的原因，使得制造的油佐劑疫苗對(duì)動(dòng)物免疫時(shí)會(huì)造成局部或全身的臨床反應(yīng)，如局部組織發(fā)炎和腫脹，甚至造成動(dòng)物的死亡，因此，一種合格的疫苗不僅要求效力檢驗(yàn)符合要求，首先還必須安全[9-10]。

為了評(píng)價(jià)H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗的安全性，本研究針對(duì)疫苗及其佐劑，直接選擇靶動(dòng)物-雞進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)；并同時(shí)進(jìn)行了兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn)、肌肉刺激性試驗(yàn)及溶血性試驗(yàn)。

急性毒性試驗(yàn)中，因給藥濃度和給藥容積已至最大，仍未出現(xiàn)雞死亡，未能測(cè)出其LD50，按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，可不必測(cè)定LD50，故而進(jìn)行一日內(nèi)最大給藥量測(cè)定試驗(yàn)，測(cè)得20倍臨床劑量為其最大給藥量，說(shuō)明該疫苗臨床使用劑量是安全的。在試驗(yàn)過程中，高劑量疫苗組及佐劑組肉雞出現(xiàn)精神沉郁，且兩組之間無(wú)明顯差別，因此主要與給予雞大體積的藥物后，且是頸背部皮下給藥，大體積的藥物對(duì)嗉囊的壓迫，使肉雞攝食減少，同時(shí)大體積多次注射對(duì)試驗(yàn)雞還存在一定的機(jī)械性損傷。

眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)中，疫苗組和佐劑組兔眼均有相似的虹膜輕度充血、腫脹，結(jié)膜充血，眼瞼伴有輕微水腫。按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，試驗(yàn)兔眼最高分為3分。因此，疫苗及佐劑對(duì)兔眼結(jié)膜雖有輕度刺激性，但仍然在正常值范圍內(nèi)，且該刺激性主要來(lái)源于佐劑。該疫苗是油佐劑疫苗，油佐劑的作用是使機(jī)體對(duì)藥物不易吸收，對(duì)藥物起緩釋與長(zhǎng)效作用。在對(duì)兔股四頭肌部位注射疫苗及佐劑后，剖檢，在注射部位，有少量的白色干酪物，在給藥部位有輕度的充血，這可能與該油佐劑不易吸收有關(guān)，刺激反正仍在正常值范圍內(nèi)，故可用于注射給藥。溶血試驗(yàn)表明，H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗未見對(duì)紅細(xì)胞有凝集和溶血作用，其滲透壓不會(huì)影響動(dòng)物細(xì)胞的正常形態(tài)及穩(wěn)定，符合注射劑的要求。上述結(jié)果提示，該疫苗安全性良好。

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