PHA復(fù)方制劑對雞免疫功能及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

劉艷艷，秦 光，李繼昌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

植物凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一類具有專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白，在獸醫(yī)臨床上可用做廣譜抗病毒藥、高效免疫增強劑；植物血凝素?zé)o種屬特異性，可廣泛用于家禽[1]、豬[2]等動物以增強免疫力。在飼料中添加黃芪多糖（Astragalus Plysaccharides，APS）可以改善蛋雞的免疫功能[3]，在飼料中添加APS可促進(jìn)肉仔雞內(nèi)臟器官的發(fā)育[4]。經(jīng)體外試驗[5]驗證，自制PHA、黃芪多糖為主的復(fù)方制劑對鼠脾臟淋巴細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用。藥物對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用會影響體內(nèi)相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)因子，IFN-γ（Ⅱ型干擾素）是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，主要由T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞分泌，對天然免疫與獲得性免疫均具有重要的作用。IFN-γ是在機(jī)體抗感染防御與Th1應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞因子，其主要的功能是免疫刺激和免疫調(diào)控，如促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞、激活巨噬細(xì)胞溶酶體的活性、促進(jìn)NK細(xì)胞的活化、激活抗原遞呈細(xì)胞、促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化及抑制Th2細(xì)胞的活化等[6-7]，同時也參與了某些自身免疫性疾病的發(fā)生，如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及Ⅰ型糖尿病[8]。IL-10由Th2細(xì)胞分泌，本身可以被Th1分泌的細(xì)胞因子抑制，并具有抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，促進(jìn)胸腺細(xì)胞增殖，促進(jìn)B細(xì)胞增殖等功能。過量的Thl細(xì)胞產(chǎn)物可引起局部慢性炎癥和基質(zhì)破壞?？刂芓h1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生或補充Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-10，調(diào)節(jié)它們的平衡有治療意義[9]。

本研究首先進(jìn)行PHA、黃芪多糖及其復(fù)方對雞脾臟淋巴細(xì)胞的增殖試驗，進(jìn)一步證明該復(fù)方制劑的體外藥效，并檢測復(fù)方制劑對新城疫Lasota疫苗免疫雞的體重、胸腺、脾臟、法氏囊的臟器指數(shù)影響，對刀豆球蛋白（ConA）誘導(dǎo)雞脾臟淋巴細(xì)胞中及新城疫Lasota疫苗免疫雞的外周血清中IL-10、IFN-γ濃度的影響，探討該復(fù)方制劑對雞及Thl、Th2型細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PHA復(fù)方制劑：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理教研室自制，本品為灰白色粉末，不溶于水，臨用時按劑量混懸于蒸餾水中；白細(xì)胞介素10試劑盒、干擾素γ試劑（購自上海勁馬生物科技有限公司）；黃芪藥材（購自哈爾濱世一堂）；ConA（購自Sigma）,批號20100108158；

雞新城疫低毒力活疫苗Lasota株（1 000羽·支-1），乾元浩生物股份有限公司（批號S0912410）；

1.2 雞脾淋巴細(xì)胞的制備

頸椎脫臼處死雞（20～30日齡），無菌取脾臟，在不銹鋼絲網(wǎng)上輕輾，收集網(wǎng)下的細(xì)胞懸液，用Hanks液洗滌細(xì)胞3次，當(dāng)細(xì)胞存活率大于95%時，用完全RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。

1.3 雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗中ConA濃度的確定

按1.2制備雞脾淋巴細(xì)胞懸液。用完全RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106細(xì)胞·mL-1，取96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入190 μL脾淋巴細(xì)胞懸液。加入不同濃度的ConA（0、0.625、1.25、2.5、5.0 和 10.0 μg·mL-110 μL。每孔總體積為 200 μL，每種處理均作4個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2完全濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后按MTT法檢測細(xì)胞增殖[10]。

1.4 不同濃度藥物的制備

根據(jù)藥物PHA及黃芪多糖的臨床常用的濃度，PHA 分別以 6.0、3.0、1.5 μg·mL-1，黃芪多糖以12.0、6.0、3.0 mg·mL-1將復(fù)方制劑藥物按 120.0、60.0、30.0 mg·mL-1濃度稀釋，備用。所有藥物現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.5 ConA誘導(dǎo)的雞脾淋巴細(xì)胞因子檢測

按1.2制備雞脾淋巴細(xì)胞懸液。用完全RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度5×106細(xì)胞·mL-1，取96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入190 μL脾淋巴細(xì)胞懸液。加入ConA（終濃度為1.25 μg·mL-1）和不同濃度的藥物10 μL。每孔總體積為210 μL，每種處理均作四個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2完全濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，各試驗組四個復(fù)孔培養(yǎng)液移入離心管內(nèi)，離心5 min（1 500 r·min-1），收上清，備用。IFN-γ、IL-10細(xì)胞因子的檢測按照說明操作。

1.6 動物分組與處理

1日齡伊莎公雞150只，購于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場，在潔凈動物房內(nèi)飼養(yǎng)。至24日齡時，檢測母源抗體為3以下，隨機(jī)分為5組，分別是空白組：灌服蒸餾水，不進(jìn)行免疫；疫苗對照組：灌服蒸餾水，在25、35日齡時滴鼻點眼免疫2次，免疫劑量按說明操作；3個不同劑量復(fù)方制劑組的免疫時間同疫苗對照組，給藥劑量結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]及預(yù)試結(jié)果，按0.05、0.2、0.3 g·kg-1劑量連續(xù)灌服3 d。各組灌服體積為2 mL。

1.7 試驗材料選取與處理

在雛雞34、44、51日齡時，即初次免疫給藥一周、再次免疫給藥一周及再次免疫給藥兩周時各組隨機(jī)取5羽，稱重，心臟取血，分離血清進(jìn)行IFN-γ、IL-10細(xì)胞因子的檢測；方法按照說明操作。精密稱定胸腺、脾臟、法氏囊的重量，進(jìn)行體重增重率和免疫臟器指數(shù)的測定

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 ConA濃度的確定

由表 1 可知，當(dāng) ConA 濃度為 5 μg·mL－1時，刺激雞脾淋巴細(xì)胞增殖的效果最顯著。本試驗采用的 ConA 濃度為 1.25 μg·mL－1，在此濃度下 ConA 可顯著促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05）。

2.2 植物血凝素與黃芪多糖對ConA誘導(dǎo)的雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子濃度測定

由表2可知，復(fù)方制劑及其主要組成藥物多糖、PHA均可以促進(jìn)雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL－10、IFN－γ的細(xì)胞因子，并以復(fù)方制劑組所產(chǎn)生的因子濃度最高（P＜0.01），說明此復(fù)方制劑組方合理。對于IL－10，在復(fù)方組成的高濃度、中濃度組中最高，多糖的表達(dá)濃度隨劑量變化呈負(fù)相關(guān)，PHA的表達(dá)與濃度無相關(guān)；對于IFN－γ，同樣在復(fù)方組成的高濃度、中濃度組中最高，PHA的增殖變化與濃度呈正相關(guān)，即濃度越高，增殖率也越高。在多糖中與劑量無關(guān)。

表1 不同濃度ConA對雞脾淋巴細(xì)胞的增殖作用（n=5）Table 1 Chicken spleen cells proliferation activity of different concent of ConA（n=5）

表2 黃芪多糖、PHA及其復(fù)方制劑對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子的影響結(jié)果(n=5)Table 2 Effects of polysaccharide,PHA and compound peparation on cytokine contents in supernatant of chicken splenic lymphocyte(n=5)

2.3 PHA復(fù)方制劑對體重增重率及免疫臟器指數(shù)影響

結(jié)果見表3。

由表3可知法氏囊、脾臟、胸腺的重量可用來評價雛雞的免疫狀況，PHA復(fù)方制劑對，體重的增重率、免疫臟器指數(shù)的變化。

表3 不同免疫時期雞增重率及胸腺、脾臟、法氏囊臟器指數(shù)測定結(jié)果（n=5）Table 3 Results of percentage of liveweightgrowth and organ index of thymus,spleen,and bursa of Fabricius of chickens in differents immune period（n=5）

在34日齡時，疫苗對照組的體重增重率顯著性高于空白對照組（P＜0.05），在44日齡時持平，54日齡時低于空白對照組（P＜0.05）說明新城疫Lasota疫苗可以在免疫初期提高體重的增重率；對于各給藥組，復(fù)方制劑低、中、高劑量組在在不同日齡高于空白對照組與疫苗對照組，以復(fù)方制劑低、中劑量組增重率顯著（P＜0.05），以上結(jié)果說明此復(fù)方制劑對體重有一定影響，在初次免疫時可使增重率顯著增加。

在整個免疫階段胸腺指數(shù)疫苗對照組與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），說明疫苗對胸腺指數(shù)無影響；對于各給藥組，復(fù)方制劑中劑量組在不同的免疫增強階段都顯著性高于空白對照組和疫苗對照組（P＜0.05），低劑量組也在一定時期顯著性高于空白對照組和疫苗對照組（P＜0.05），說明該復(fù)方制劑可以提高胸腺指數(shù)，以中劑量組提高效果最佳。

疫苗有在免疫初期可以顯著增加脾臟指數(shù)（P＜0.05）；低劑量、中劑量組在中期、后期顯著性（P＜0.05）高于其他各組，說明此復(fù)方制劑可以提高脾臟指數(shù)，以中劑量組提高效果最佳。

法氏囊指數(shù)疫苗對照組與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），說明疫苗對法氏囊指數(shù)無影響；給藥組在不同時期都有顯著性高于對照組（P＜0.05）時，但34日齡低劑量組與51日齡低、高劑量組等無顯著性差異，說明復(fù)方制劑在此劑量范圍內(nèi)可以增加法氏囊指數(shù)，以復(fù)方制劑中劑量組較為明顯。

2.4 PHA復(fù)方制劑對雞血清中細(xì)胞因子影響的檢測結(jié)果

PHA復(fù)方制劑對雞血清中細(xì)胞因子影響的結(jié)果見表4。

表4 PHA復(fù)方制劑對雞血清細(xì)胞因子濃度影響(n=5)Table 4 Effects of PHA compound peparation on cytokine contents in serum of chickens(n=5)(ng·L-1)

IL-10在雞血清中的濃度，在34日齡時，疫苗對照組低于與空白對照組（P＜0.01），但在44、51日齡時，則高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01），說明在二次免疫后，疫苗可使IL-10增高；各給藥組，在34日齡時復(fù)方制劑低劑量、中劑量組顯著性高于其他各組（P＜0.01），復(fù)方制劑高劑量組與疫苗對照組無顯著性差異（P＞0.05）；44日齡，復(fù)方制劑中劑量組仍顯著性高于其他各組（P＜0.05），復(fù)方制劑低劑量、高劑量與空白對照組相同，但低于疫苗對照組（P＜0.05）；51日齡各給藥組均顯著性低于疫苗對照組（P＜0.01），說明復(fù)方制劑在34、44日齡時有提高IL-10的作用。

IFN-γ在雞血清中的濃度，空白對照組、疫苗對照組一直無顯著性差異（P＞0.05），說明新城疫LaSota疫苗對IFN-γ無明顯影響；對于復(fù)方制劑給藥組，復(fù)方制劑中劑量組，低劑量組在34、44日齡時一直顯著性低于疫苗對照組和空白對照組（P＜0.05），但隨著免疫的加強的進(jìn)行，在51日齡有所升高，但與兩個對照組無顯著性差異（P＞0.05），說明復(fù)方制劑在免疫初期可使IFN-γ降低，加強免疫兩周后無顯著影響。

3 討論與結(jié)論

免疫臟器指數(shù)在一定程度上可以作為衡量免疫作用大小的指標(biāo)。本試驗中，在不同的免疫時期，PHA復(fù)方制劑各給藥劑量組，以中劑量組可明顯提高多各免疫臟器指數(shù)，在一定劑量下，有增加體重的作用。毛小娟等研究表明[13]，黃芪多糖能增加正常小鼠脾臟的重量，且能完全對抗皮質(zhì)激素引起的胸腺及腸淋巴結(jié)的顯著萎縮，并可對抗環(huán)磷酰胺造成的脾臟重量顯著下降；PHA復(fù)方制劑各給藥劑量組以中劑量組可以明顯提高多個免疫臟器指數(shù)，這與孫才華[14]報道一致，即從中藥方劑中提取的復(fù)合多糖能促進(jìn)正常雛雞腔上囊、脾、胸腺的發(fā)育，其相對重量明顯增加；張樂萃等認(rèn)為復(fù)方中藥多糖能夠促進(jìn)雛雞免疫器官的生長發(fā)育，從而提高機(jī)體免疫功能[15]。本研究表明該復(fù)方制劑可以通過增加臟器指數(shù)提高機(jī)體免疫力，與其主要成分黃芪多糖相一致，并說明此復(fù)方制劑的藥效與劑量有關(guān)系，并非劑量越大，效果越好，說明該復(fù)方制劑的給藥劑量非常關(guān)鍵。

在免疫系統(tǒng)中，T細(xì)胞占有極其重要的地位，Momsnnaeta等首先根據(jù)長期培養(yǎng)的小鼠CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和介導(dǎo)免疫功能的不同[16]，將其分為Thl和Th2兩個亞群，Thl細(xì)胞以表達(dá)IFN-γ[17]和IL-2[18]為主，Th2細(xì)胞以表達(dá)IL-10、IL-4為主。Thl和Th2在介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中有不同的作用,前者主要參與促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，后者主要參與促進(jìn)體液免疫[19]。Thl/Th2失衡一直被認(rèn)為是許多疾病的發(fā)病機(jī)制之一。

本試驗研究表明不同濃度復(fù)方藥物及其主要成分PHA和黃芪多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的含量有不同程度的影響，復(fù)方藥物比任意單味藥調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的能力都強，說明此復(fù)方在調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子時具有協(xié)調(diào)增強的作用，組方合理。自制復(fù)方制劑在按體重0.05、0.2、0.3 g·kg-1的給藥范圍內(nèi)，可提高胸腺等免疫臟器的指數(shù)，說明具有一定的免疫增強作用，并在外周血中有短時促進(jìn)Th2型的IL-10的產(chǎn)生，暫時降低TH1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，這些結(jié)果意味著復(fù)方免疫增強劑可以通過調(diào)節(jié)Thl/Th2的比例起到免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，以PHA、黃芪多糖為主藥的復(fù)方制劑可以提高新城疫疫苗的免疫作用，具有免疫增強的作用，其機(jī)理與調(diào)節(jié)Thl/Th2的作用有關(guān)。

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