患子宮內(nèi)膜炎奶牛免疫應(yīng)答變化規(guī)律的研究

李德軍，劉運(yùn)楓，周曉玲，郭定宗

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150010；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

子宮內(nèi)膜炎是奶牛最為常見的一種產(chǎn)科疾病，是引起奶牛不孕的重要原因之一，特別是患有隱性子宮內(nèi)膜炎的奶牛，由于沒有明顯的臨床癥狀，大多數(shù)情況下都延誤了最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致患牛因久治不育而被淘汰，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

正常情況下，子宮通過機(jī)械性保護(hù)屏障和免疫功能阻止和消滅侵入的病原體，以維持正常生理活動(dòng)的進(jìn)行。一旦這兩種防御體系受到破壞，就會(huì)發(fā)生子宮內(nèi)的炎癥過程。子宮具有區(qū)別于其他器官的防御機(jī)制，但非特異性免疫和特異性免疫仍然是子宮免疫反應(yīng)的兩大主要類型。病原菌侵入機(jī)體要通過兩道屏障：第一道屏障即子宮的物理排除能力，若細(xì)菌突破這道防線，就會(huì)遇到第二道防線即子宮內(nèi)膜中分布的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞及由他們分泌的細(xì)胞因子，從而激發(fā)了免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫球蛋白[2]。本研究通過對(duì)血液中淋巴細(xì)胞亞型（CD4+、CD8+）、血液和子宮分泌物中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）的含量變化的監(jiān)測(cè)，探討患子宮內(nèi)膜炎的奶牛特異性防御系統(tǒng)的變化過程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組

在某大型奶牛場(chǎng)選擇膘情良好，沒有外傷、乳房炎、營(yíng)養(yǎng)代謝不良等疾病及未經(jīng)抗生素治療的3～8歲產(chǎn)后表現(xiàn)健康的荷斯坦奶牛，分別于產(chǎn)后7、14、21、28、35、42、49 d 七個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血液及子宮分泌物的采集。并在21 d時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)牛的陰道分泌物進(jìn)行檢查，將陰道內(nèi)有粘液膿性和膿性分泌物排出的奶牛作為臨床型子宮內(nèi)膜炎組（CE），共有30頭；將陰道分泌物中中性粒細(xì)胞大于18%作為亞臨床型子宮內(nèi)膜炎組（SE），共有28頭；將陰道分泌物中中性粒細(xì)胞小于18%作為對(duì)照組（N），共有10頭[3]。

1.2 血液樣品的采集及處理

肝素抗凝血1 mL，緩慢加入含有等體積的淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1 500 r·min-1，離心15 min。小心吸取中間白膜層，加入PBS，1 500 r·min-1，離心10 min，重復(fù)2次，制成淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1。取1 mL細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1，離心10 min，棄上清。加入100 μL PBS懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入已含有10 μL特異性FITC標(biāo)記的CD4+或CD8+抗體的塑料離心管，4℃孵育30 min，洗滌2次。加入300 μL PBS，避光，1 h內(nèi)上BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

另取2 mL非抗凝血，水浴30 min，4 000 r·min-1，離心5 min，取血清，按照濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司檢測(cè)免疫球蛋白（IgG/IgA/IgM）的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3 子宮分泌物樣本的采集及處理

消毒外陰，借助開口器，將含有20 mL滅菌乳酸林格氏液的子宮清洗器送入子宮體內(nèi)，通過直腸內(nèi)的另一只手將子宮內(nèi)的液體由子宮體移到子宮角進(jìn)行反復(fù)沖洗。然后用一個(gè)長(zhǎng)60 cm的硬質(zhì)塑料管將分泌物吸出，取一滴滴于載玻片上，風(fēng)干、染色、鏡檢；剩余部分貯存于無菌試管中，-20℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定方法同血液樣本。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS for Windows 6.12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中CD4+、CD8+細(xì)胞變化

CE組血液中CD4+百分?jǐn)?shù)除第14天外，其他各時(shí)間點(diǎn)均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。SE組在產(chǎn)后第7和第21天時(shí)與對(duì)照組比差異極顯著（P＜0.01），其他時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異（P＞0.05）。CE組和SE組比較，僅在28和49 d時(shí)存在顯著性差異（P＜0.01)(見圖 1） 。

圖1 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD4+百分?jǐn)?shù)變化Fig.1 Percentage change of CD4+T cells in blood of cows with endometritis

CE組CD8+百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）。SE組在第28、35和42天時(shí)與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），除第21天無顯著性差異外（P＞0.05)，其他各時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD8+百分?jǐn)?shù)變化Fig.2 Percentage change of CD8+T cells in blood of cows with endometritis

2.2 血液中CD4+/CD8+變化

由圖3可知，SE組和CE組CD4+/CD8+比值顯著低于對(duì)照組，SE組CD4+/CD8+比值高于CE組。

2.3 血液和子宮分泌物中IgG、IgA、IgM濃度的變化

從表1可見，SE組和CE組IgG濃度極顯著低于N組（P＜0.01)。SE組和CE組變化比較在21和35 d時(shí)無顯著性差異（P＞0.05)。

三組IgA濃度變化雖然較緩慢，但SE、CE組與N組間均存在極顯著性差異（P＜0.01)。SE組變化較其余兩組顯著，在產(chǎn)后28 d時(shí)，IgA的濃度有所降低，隨后很快又呈升高趨勢(shì)。

CE組血清中IgM濃度極顯著低于N組（P＜0.01)，產(chǎn)后第49天時(shí)達(dá)到峰值。SE組血清中IgM濃度產(chǎn)后第2周有所下降，之后又開始回升，升高幅度極顯著高于CE組，且在產(chǎn)后第6周時(shí)，濃度值高于N組。

圖3 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD4+/CD8+比值的變化Fig.3 Ratio Change of CD4+/CD8+in blood of cows with endometritis

表1 子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中IgG、IgA、IgM濃度的變化Table 1 Concentration change of IgG,IgA,IgM in serum of cows with endometritis （mg·mL-1）

表2 子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物中IgG、IgA、IgM濃度的變化Table 2 Concentration change of IgG、IgA、IgM in uterine secretion of cows with endometritis （mg·mL-1）

由表2可知，SE組和CE組子宮分泌物中，IgA和IgM的濃度變化高于N組，而IgG的濃度變化沒有規(guī)律性。SE組和CE組子宮分泌物中IgG濃度變化呈上升趨勢(shì)，在產(chǎn)后頭3周均低于N組，之后CE組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01)，SE組也在產(chǎn)后第35天開始與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05)。

3 討論

3.1 子宮的細(xì)胞免疫防御機(jī)制

健康、未孕的動(dòng)物子宮內(nèi)最主要的白細(xì)胞亞型是T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞主要是CD4+(輔助型)、CD8+(細(xì)胞毒素型)和CD2+亞群，這些細(xì)胞的遷移和分布，在子宮局部免疫中起著重要作用。T細(xì)胞亞群能反映宿主免疫調(diào)節(jié)能力，CD4+/CD8+比值更能反映宿主細(xì)胞免疫狀態(tài)，為預(yù)后提供參考。當(dāng)局部體液免疫應(yīng)答的作用受到限制時(shí)，細(xì)胞免疫在子宮免疫防御方面就變得很重要[4]。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫和體液免疫的重要環(huán)節(jié)，能在抗原刺激下活化產(chǎn)生功能各異的淋巴因子，調(diào)節(jié)體液免疫[5]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，SE組血液中CD4+比例顯著升高；CD8+細(xì)胞呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，說明感染初期，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞均被活化，但CD4+細(xì)胞被活化的程度比CD8+明顯，所以CD4+/CD8+比值也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。說明SE組輔助性T淋巴細(xì)胞的作用要強(qiáng)于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的作用，此時(shí)機(jī)體的免疫力主要由輔助性T淋巴細(xì)胞激活細(xì)胞因子，產(chǎn)生大量可以中和抗原的抗體。輔助性T淋巴細(xì)胞還可以誘導(dǎo)T和B淋巴細(xì)胞在局部淋巴結(jié)的增殖。這些淋巴細(xì)胞隨后遷移到子宮內(nèi)膜作為細(xì)胞介導(dǎo)和抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效應(yīng)器。

而CE組血液中CD4+、CD8+細(xì)胞比例變化的波動(dòng)，決定了CD4+/CD8+比值呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。說明CE組產(chǎn)后以輔助T淋巴細(xì)胞的作用為主，接著CD8+被活化激活后，抑制了CD4+的作用，從而機(jī)體表現(xiàn)免疫力降低，但在產(chǎn)后第7周后，機(jī)體又開始逐漸恢復(fù)到原來的水平。

3.2 子宮的體液免疫防御機(jī)制

產(chǎn)后生殖道疾病的發(fā)展在很大程度上取決于奶牛本身的天然抵抗力。而且依賴于局部子宮的免疫機(jī)制。而了解這一機(jī)制，就要研究IgS的水平和分泌。一些研究已經(jīng)證明了牛子宮分泌物中有Ig存在并且具有抵抗感染的作用，本試驗(yàn)對(duì)子宮分泌物中三種免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果也說明了這點(diǎn)。這些免疫球蛋白可作為調(diào)理素增強(qiáng)吞噬作用來直接溶解細(xì)菌或者刺激補(bǔ)體途徑來完成對(duì)細(xì)菌的消滅作用[6-7]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三種免疫球蛋白在血中和子宮分泌物中的含量各不相同。血液中主要以IgG、IgM為主，IgA含量很少。而子宮分泌物中，主要以IgG和IgA為主，IgM占少數(shù)。說明當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，子宮分泌物中IgA的量超過了IgM的生成量，此結(jié)果表明IgA在炎癥過程中，除由外周血中轉(zhuǎn)入子宮腔內(nèi)外，還可由子宮粘膜進(jìn)行表達(dá)，這也證明了當(dāng)炎癥發(fā)生后，子宮粘膜的局部免疫發(fā)揮著主要的作用，這與Pierce研究的結(jié)果相似[8]。

本試驗(yàn)中，子宮分泌物IgA和IgM的含量在炎癥過程中呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而IgG呈現(xiàn)升高變化，這與Kowald等的報(bào)道不完全相同，這可能是由于IgG除了可由子宮內(nèi)膜合成外，還可由血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來，而IgA和IgM主要由子宮內(nèi)膜合成，由于子宮內(nèi)膜受損導(dǎo)致二者的生成減少[9-10]。Butt等經(jīng)過試驗(yàn)證明，子宮中多數(shù)IgG2和一半IgG1來自血清。由此可見，當(dāng)子宮發(fā)生炎癥時(shí)，機(jī)體會(huì)動(dòng)員免疫防御系統(tǒng)來參與免疫應(yīng)答[11]。

4 結(jié)論

通過本試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CD4+/CD8+比值降低時(shí)，血液中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA） 的含量呈升高趨勢(shì)，說明細(xì)胞免疫降低時(shí)，體液免疫正在加強(qiáng)，機(jī)體通過對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來抵御炎癥反應(yīng)的過程。

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