豬BYSL基因克隆、序列特征及表達分析

牛步月，閆曉紅，狄生偉，王 洋，李海濤，熊遠著，王希彪*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，武漢 430070）

胚胎著床是一個復雜的生理過程，主要包括胚胎滋養(yǎng)層細胞與著床期子宮內(nèi)膜細胞的起始粘附以及胚胎滋養(yǎng)層細胞向子宮內(nèi)膜的適度侵入。其中，起始黏附過程極為重要，它能啟動母胎之間的早期交流，利于著床過程的順利進行[1]。

Trophinin、Tastin和Bystin為上世紀末新發(fā)現(xiàn)的一類介導胚胎著床的細胞粘附分子,其中Trophinin是一種內(nèi)源性膜蛋白，Tastin和Bystin均為細胞質(zhì)蛋白。在胚泡植入期，Trophinin分布在子宮內(nèi)膜上皮細胞以及與之接觸的胚泡中。早期的研究發(fā)現(xiàn)Trophinin位于細胞質(zhì)的氨基端可以與Tastin結(jié)合，形成細胞粘附分子復合物，介導胚泡與子宮內(nèi)膜的粘附[2]。1998年，Suzuki等利用酵母雙雜交技術從人胚胎滋養(yǎng)層細胞中分離出Bystin[3]，體外蛋白質(zhì)結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)Trophinin和Tastin并不能直接結(jié)合，而是借助于Bystin形成Trophinin-Bystin-Tastin細胞粘附分子復合物，一起介導著床時胚泡滋養(yǎng)外胚層和子宮內(nèi)膜上皮細胞游離端細胞之間的獨特粘著。之后的研究發(fā)現(xiàn)Bystin可使細胞粘附得到鞏固[4-5]。該復合體的異常表達，可通過影響胚胎與子宮內(nèi)膜的起始黏附導致著床失敗[1]。此外，在胎盤早期形成過程中，三者在子宮母胎界面細胞中表達，于妊娠10周以后完全消失，表明它們可能在哺乳動物早期胎盤形成過程中也起著重要作用[6]。

編碼Trophinin的基因僅存在于哺乳動物，基因敲除研究發(fā)現(xiàn)Trophinin并非小鼠胚胎著床的關鍵基因[7]。編碼Bystin的基因為BYSL（Bystin-like），該基因卻存在于多種生物中，例如酵母、昆蟲、蛇和哺乳動物等[8]。Aoki等通過基因敲除試驗發(fā)現(xiàn)，BYSL基因敲除小鼠的胚胎可以正常著床[9]，但在第6天死亡，表明該基因是著床后小鼠胚胎存活的關鍵基因。Adachi等利用RNAi技術發(fā)現(xiàn)，BYSL基因表達下調(diào)可抑制胚泡的形成[10]；BYSL基因沉默也可抑制胚胎干細胞的增殖，表明BYSL基因也是著床前小鼠胚胎存活的關鍵基因。

鑒于BYSL基因在哺乳動物胚胎發(fā)育和著床過程中的重要作用，我們選擇該基因作為豬繁殖性狀的候選基因。對基因的序列分析和表達模式研究，是開展基因功能研究的前提和基礎。但是，通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索沒有發(fā)現(xiàn)豬BYSL基因序列，該基因的表達模式研究尚未見報道。因此，本研究利用同源擴增方法對豬BYSL基因進行克隆；利用生物信息學軟件進行序列特征分析；并利用Realtime PCR技術分析該基因的時空表達模式，以期為開展豬繁殖性狀分子遺傳基礎研究提供新的基因素材。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：9頭健康民豬由黑龍江省蘭西縣民豬保種場提供，分別在性成熟前（1月齡、2.5月齡）和性成熟（4月齡）3個時間點進行屠宰，無菌采取子宮組織；同時，采取4月齡民豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、小腸、脂肪、卵巢和子宮等組織樣，置于液氮中速凍后送回實驗室-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：pMD18-T載體、DNA marker DL2000、SYBR Green I試劑盒（均購自TaKaRa公司）；Trizol Reagent RNA提取試劑盒和DEPC（購自Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒等（購自Promega公司）；凝膠回收試劑盒（購自上海生工）；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提

取100 mg組織樣置于無RNA酶的離心管中，充分勻漿后采用Trizol法提取總RNA，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，利用紫外分光光度計檢測其濃度后，置于-70℃保存?zhèn)溆?。具體操作按照RNA提取試劑盒說明書進行。

1.2.2 引物設計與合成

下載人BYSL基因mRNA序列(NM_004053)，登錄NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行BLASTn比對，獲取同源性大于80%的豬ESTs序列。利用DNAstar軟件包中的Sequencher程序?qū)@些ESTs序列進行拼接。以拼接序列為靶序列，用Primer 5.0軟件設計CDS擴增引物。以擴增獲得的cDNA序列為靶序列，參照人BYSL基因組結(jié)構，設計Real-time PCR引物，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：

cDNA擴增引物：

熒光定量RT-PCR引物：

1.2.3 cDNA序列擴增

取3 μg子宮組織總RNA，以Oligo(dT)18為引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以cDNA單鏈為模板，進行CDS序列擴增。

PCR 反應體系：1 μL dNTP，1 μL Taq 聚合酶，1.5 μL Mg2+，12.5 μL Buffer，上下游引物各 0.5 μL，0.5 μL cDNA模板，用ddH2O將體系調(diào)整至25 μL。PCR擴增條件：94℃4 min；94℃45 s，60℃45 s，72℃90 s，擴增35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收目的片段（膠回收操作參見試劑盒說明書）。回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過藍白斑篩選陽性克隆，利用M13引物進行菌落PCR鑒定，挑選陽性菌液送上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 豬BYSL基因時空表達模式

等同條件下反轉(zhuǎn)錄各組織的cDNA，然后將3頭豬同一組織反轉(zhuǎn)錄cDNA混合，構建代表特定組織和特定月齡子宮組織的cDNA池。以β-actin為內(nèi)參，利用SYBR Green I熒光染料進行Real-time PCR。反應體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM,0.5 μL Rox II，上下游引物各 1 μL，0.5 μL cDNA混合模板，用ddH2O將體系調(diào)整至25 μL。PCR擴增條件：95℃10 s；95℃ 55 s，60℃ 30 s，30個循環(huán)。Real-time PCR反應由ABI 7500 Real-time PCR儀 (Applied Biosystems公司）完成。BYSL和β-actin標準曲線由各自RT-PCR產(chǎn)物(1/10，1/100，1/1 000和1/10 000）梯度稀釋后建立。每個樣本重復測定3次。內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的評估、β-actin和BYSL表達量的計算由SDS軟件V1.3.1(Applied Biosystems 公司)完成。利用 2-ΔΔCt法計算BYSL基因相對表達量，利用SPSS10.0軟件對目的基因在不同發(fā)育階段子宮組織的表達量進行差異顯著性檢驗。

1.2.5 序列分析與結(jié)構預測

將經(jīng)RT-PCR獲得的豬BYSL基因的cDNA序列利用ORF Finder程序進行最大開放閱讀框預測；利用DNAstar軟件包中的EditSeq程序進行氨基酸序列預測；利用ProtParam軟件進行蛋白理化特性預測；利用Prosite軟件進行蛋白功能位點分析；利用CDD數(shù)據(jù)庫分析豬BYSL的保守結(jié)構域；從GenBank數(shù)據(jù)庫下載人（NP_004044）、牛（NP_001014924）、狒狒（NP_001162223）、小鼠（NP_058555）、大鼠（NP_872615）、狗（XP_532135.2）、雞（XP_418047）、斑馬魚（NP_957400）和非洲爪蟾（NP_001085058）的BYSL氨基酸序列，利用EBI在線多序列比對軟件Clustalw2.0進行序列同源性比對分析。利用分子進化遺傳分析軟件Mega4，采用鄰近相連算法NJ（Neighbor joining Model）構建系統(tǒng)進化樹，計算距離采用泊松校驗（Poissoncorrection）的方法，自展檢驗（Bootstrap test）估計NJ法所構系統(tǒng)樹的可靠性，重復次數(shù)5 000次，其余參數(shù)取默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA序列擴增

以豬卵巢組織cDNA為模版，B1、B2和B3引物對為特異引物進行RT-PCR擴增，均獲得與預期擴增片段大小相一致的特異性條帶（見圖1）。

序列測定和分析表明B1、B2和B3引物對擴增片段長度分別為629、836和499 bp。

圖1 豬BYSL基因部分cDNA片段擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of partial cDNA of porcine BYSL gene

2.2 序列分析與結(jié)構預測

采用ProtParam軟件對豬BYSL蛋白進行一級結(jié)構預測，結(jié)果表明該蛋白分子量約為49.2 ku，等電點為8.67，是堿性蛋白，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為49.07。利用Prosite軟件分析顯示，豬BYSL蛋白可能存在 1個 N－糖基化位點（N－glycosylation site），6個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site），7個酪蛋白激酶II磷酸化位點（Casein kinase II phosphorylation site)，1 個豆蔻酰化位點 （N－myristoylation site），3個 Tyrosine kinase phosphorylation site。

利用CDD數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)豬BYSL蛋白包含一個Bystin保守結(jié)構域，結(jié)構域位于134～435氨基酸處（見圖2）。

圖2 豬BYSL基因保守結(jié)構域Fig.2 Conserved domain of porcine BYSL

利用Clustalw 2.0軟件比對分析預測序列與人BYSL基因的編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)二者具有87%的相似性。進一步將預測的豬BYSL蛋白序列與人、牛、狒狒、小鼠、大鼠、狗、雞、斑馬魚和非洲爪蟾等物種的BYSL蛋白序列進行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬與人、牛、狒狒、小鼠、大鼠、狗、雞、斑馬魚和非洲爪蟾的BYSL蛋白序列相似度分別為90%，90%，89%，87%，87%，87%，68%，71%和69%。因此將預測序列命名為豬BYSL基因（GenBank：EF530129）。

進一步選取上述10種動物的BYSL蛋白序列，利用MEGA4.1（軟件）構建系統(tǒng)進化樹，分析發(fā)現(xiàn)豬BYSL基因在分子進化上與人和牛的親緣關系較近(見圖 3)。

圖3 BYSL系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic relationship of BYSL

2.3 豬BYSL基因時空表達模式分析

為了研究豬BYSL基因的空間表達模式，利用熒光定量RT－PCR方法檢測了BYSL基因在4月齡民豬子宮、卵巢等10種組織中的表達量。結(jié)果顯示，BYSL基因在所檢測的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、小腸、脂肪、子宮和卵巢等組織中均表達，其中在心臟中表達量最高，其次為肝臟和腎臟，在子宮、卵巢、胃和小腸組織中為中等表達，在脾臟表達量較低，肺臟表達量最低（見圖4）。

為了研究豬BYSL基因的時間表達模式，利用熒光定量RT－PCR方法檢測BYSL基因在性成熟劑（1月齡，2.5月齡）和性成熟后（4月齡）3個時間點豬子宮組織中的表達情況。結(jié)果顯示，BYSL基因表達量隨著月齡的增加不斷升高，在1月齡最低（2.5月齡較高），4月齡最高，方差分析結(jié)果表明，4月齡子宮組織中表達量顯著高于1月齡和2.5月齡（P＜0.05）而1月齡和2.5月齡基因表達量差異不顯著（見圖5）。

圖4 豬BYSL基因的組織表達譜Fig.4 Tissue expression profile analysis of porcine BYSL

圖5 豬BYSL基因子宮組織表達譜Fig.5 Uteurs tissue expression profile analysis of porcine BYSL gene

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)合RT-PCR技術和生物信息學方法克隆了豬BYSL基因的cDNA序列，ORF Finder程序分析發(fā)現(xiàn)所獲得的序列包含一個由1 308個堿基組成的開放讀碼框，編碼436個氨基酸。蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果表明，豬BYSL含有一個bystin保守結(jié)構域和多個蛋白激酶磷酸化位點。胚胎著床過程中，胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細胞的粘附，會觸發(fā)一種信號傳導級聯(lián)系統(tǒng)，引起胚胎滋養(yǎng)層細胞迅速增殖[11]。豬BYSL中存在著潛在的蛋白激酶磷酸化位點，很可能在這一信號傳導中扮演重要角色。與其他動物氨基酸序列比較結(jié)果顯示，物種間進化關系越近則它們的BYSL蛋白序列的相似度越高，可見該基因在進化過程中具有較高的序列保守性。通過對豬BYSL基因核苷酸序列和氨基酸序列分析、蛋白結(jié)構和功能的預測與分析，進一步證實了本研究所獲得序列的正確性。

由于DNA非編碼區(qū)序列常發(fā)生突變、缺失等現(xiàn)象，且編碼區(qū)的突變不一定引起氨基酸序列的變化，因此，本試驗利用豬BYSL基因與其他動物氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析。分析結(jié)果表明建樹動物在進化關系上可分為哺乳類動物和非哺乳類動物兩大類。其中哺乳類動物中，小鼠和大鼠為一組，人、狒狒、牛、狗和豬等為一組。同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析表明豬與人、牛等高等哺乳動物的親緣關系最近，其次是鼠類，然后是魚類，這與動物學上的分類結(jié)果趨于一致，從一定程度上反映了這些物種的進化關系。

基因的時空表達模式分析是基因功能研究的基礎，對深入研究基因的表達、蛋白的分泌以及基因作用的靶組織都有重要的意義。本研究以民豬為研究對象，分析BYSL基因的時空表達模式。研究發(fā)現(xiàn)該基因在子宮和卵巢組織等10個組織中均表達；對不同月齡子宮組織表達模式研究發(fā)現(xiàn)，BYSL的表達量隨著子宮的發(fā)育成熟而不斷升高，在4月齡時表達量最高。民豬是生活在東北地區(qū)的著名豬種，具有較高的繁殖性能，在4月齡達到初情期[12]。BYSL基因的表達規(guī)律與民豬子宮發(fā)育成熟相一致，據(jù)此，我們推測該基因可能在豬生殖過程中發(fā)揮作用，但其是否為子宮發(fā)育成熟的關鍵因子、是否在豬胚胎著床過程中發(fā)揮關鍵作用，仍有待進一步研究。

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