新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成及其相關(guān)基因的檢測

任曉鏷 陳 偉，2* 張利莉

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室/塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300)

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)作為一種條件致病菌，其生物膜形成(biofilm formation，BF)是重要的致病因子之一。同時由于形成生物膜，抗生素藥物無法殺死膜內(nèi)部的病原菌，導(dǎo)致所致疾病的反復(fù)發(fā)作且難以治愈，如醫(yī)院院內(nèi)感染和奶牛乳房炎[1]。與生物膜形成有關(guān)的基因種類很多，導(dǎo)致來源不同的表皮葡萄球菌生物膜形成機制并不相同，因此從基因水平了解生物膜形成機制顯得尤為重要。

奶牛乳房炎是一種由病原微生物引起的奶牛泌乳系統(tǒng)疾病，該疾病嚴重制約著奶牛業(yè)的健康發(fā)展。在引起奶牛乳房炎的復(fù)雜病原菌中，表皮葡萄球菌的分離率達50%。本研究檢測了分離自新疆南疆奶牛場隱性乳房炎乳樣的表皮葡萄球菌其生物膜形成表型及相關(guān)基因，為該地區(qū)表皮葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎防制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

PCR儀(Bio－Rad)，96孔板(Labphil)，恒溫培養(yǎng)箱(上海)，移液器(Eppendorf)等。

1.2 實驗藥品

PCR相關(guān)試劑均購自Takara公司，實驗所需引物均由上海生工合成，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基，BactoTM)等。

1.3 實驗菌株

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 35984(BF+，ica+)、ATCC12228(BF－，ica－)由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈送，其它表皮葡萄球菌均由本實驗室從當?shù)啬膛霾蓸臃蛛x鑒定后獲得。

1.4 表皮葡萄球菌生物膜形成檢測

根據(jù)Christensen等的方法[2]并略做改動。按1:100的接種比例將過夜培養(yǎng)的菌液30μl，接種至3 ml培養(yǎng)基中，振蕩搖勻后，吸取200μl至96孔細胞培養(yǎng)板中，每株接種6孔。每一培養(yǎng)板中同時設(shè)陽性對照(ATCC 35984)、陰性對照(ATCC 12228)與空白對照(等體積的TSB培養(yǎng)基)各6孔。37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，輕輕拍出培養(yǎng)液，無菌水洗板4次，每次振搖30下左右，洗去未粘附細菌。56℃烘干固定1 h，50μl 0.5%結(jié)晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37℃晾干，用酶標儀測定波長490 nm處的OD值。所有生物膜形成檢測實驗均在不同時間重復(fù)3次。

1.5 表皮葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因PCR檢測

1.5.1 ica的檢測

[3]設(shè)計胞間多糖黏附素基因ica(intercellular adhesion，ica)基因座部分片段引物序列，icaAB－F－Se:5’－TTA TCA ATG CCG CAG TTG TC－3’，icaAB－R－Se:5’－GTT TAA CGC GAG TGC GCT AT－3’，預(yù)期片段長度為546 bp。擴增條件:94℃，5 min;94℃，30 s;55℃，1 min;72℃，40 s，30個循環(huán);72℃，10 min。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.5.2 ica非依賴型生物膜形成相關(guān)基因的檢測

參考文獻[4－6]選擇5個與表皮葡萄球菌生物膜形成有關(guān)的基因，并設(shè)計引物(見表1)。

表1 非ica依賴型生物膜形成相關(guān)基因

PCR擴增條件為:95℃，5 min;95℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1 min;30個循環(huán);72℃，10 min。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果和分析

2.1 表皮葡萄球菌生物膜形成的檢測

通過微量板半定量法對從當?shù)啬膛鲭[性乳房炎陽性乳樣中分離出的54株表皮葡萄球菌進行生物膜形成檢測，結(jié)果表明其中有22株表皮葡萄球菌能形成不同程度的生物膜，占所檢測表皮葡萄球菌的41.1%。這說明在當?shù)啬膛瞿苄纬缮锬さ娜榉垦妆砥て咸亚蚓呀?jīng)占了相當大的比例，需引起足夠重視。尤其是在臨床治療奶牛乳房炎時，應(yīng)該按照治療生物膜相關(guān)感染的策略，加大抗生素劑量，延長治療周期，徹底殺死病原菌[1]。

2.2 ica基因座在所分離表皮葡萄球菌的存在情況

檢測了56株表皮葡萄球菌ica基因座的分布情況，未發(fā)現(xiàn)該基因座存在于所分離的表皮葡萄球菌中。該結(jié)果表明分離自本地區(qū)的奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌不含有ica基因座。而這些不含ica基因座且又能形成生物膜的表皮葡萄球菌，其生物膜形成機制屬于ica非依賴性。

2.3 ica非依賴型生物膜形成相關(guān)基因的檢測結(jié)果

對56株分離得到的表皮葡萄球菌進行aap、bhp、atlE、sarA、fbe5個基因的PCR檢測。結(jié)果表明不同株的表皮葡萄球菌含有的不同基因，其生物膜形成能力也有差異，具體結(jié)果見表2。其中4株含有bhp基因的表皮葡萄球菌有3株能形成程度不同的生物膜，而18株含有sarA基因的表皮葡萄球菌只有8株能形成生物膜，且生物膜形成強陽性臨床分離菌株5－125－C含有aap基因，5－65－1含有fbe基因。

表2 PCR擴增結(jié)果統(tǒng)計

3 討論

3.1 表皮葡萄球菌生物膜形成過程

表皮葡萄球菌生物膜形成主要包括兩個階段:表皮葡萄球菌的初始黏附階段和聚集階段。初始黏附(Primary attachment)即細菌直接或與宿主體內(nèi)的基質(zhì)蛋白等因子作用間接附著在生物材料表面的過程。這一階段有很多相關(guān)因子的參與，如自溶素蛋白AtlE(Autolysin AtlE)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白Fbe(Fibrinogen binding protein，F(xiàn)be)和葡萄球菌表面蛋白(Staphyloccal surface protein，Ssp1)等。其中atlE基因編碼1335個氨基酸的AtlE蛋白，分子量約為148kD，AtlE表達于細胞表面，包含60kD和53kD兩個結(jié)構(gòu)域，分別具有酰胺酶和氨基葡糖苷酶功能，60kD蛋白在黏附過程中可能具有中要作用。另一重要基因為fbe，編碼纖維原結(jié)合蛋白，分子量約為119kD，為纖維蛋白原配體[7]。另外也有文獻指出，atlE基因編碼的AtlE蛋白，具有黏附纖連蛋白(vitronectin，Vn)活性，可以促使表皮葡萄球菌與宿主蛋白包被的生物材料結(jié)合。但AtlE蛋白并非直接介導(dǎo)黏附，而是通過釋放胞外DNA在生物膜形成過程中起作用，特異性的AtlE抗血清并不能阻止表皮葡萄球菌的黏附;而Fbe蛋白，可能與宿主的纖維蛋白原(Fg)結(jié)合，介導(dǎo)表皮葡萄球菌黏附于生物材料的表面，從而促使生物膜形成，與表皮葡萄球菌的致病性有一定關(guān)系[8]。在本實驗中，atlE基因和fbe基因的檢出率分別為55%和50%，這個結(jié)果說明在生物膜的形成過程中可能還需要這些基因的共同作用才能使這兩個基因發(fā)揮相應(yīng)作用。

細菌在生物材料表面初始附著后，即調(diào)整其基因表達，在生長繁殖的同時分泌大量胞外多糖(Exopolysacchride，EPS)。EPS可粘結(jié)單個細菌而形成細菌團塊，即微菌落(Microcolony)。EPS的主要成分是胞間多糖粘附素，由ica基因座控制表達。大量微菌落使生物膜加厚，因此EPS分子的產(chǎn)生對生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)展十分重要[9，10]。在聚集階段，表皮葡萄球菌之間相互連接從而形成生物膜。它需要聚集相關(guān)蛋白AAP及生物膜形成相關(guān)蛋白BHP的參與。有報道稱在表皮葡萄球菌中有aap和bhp存在，而沒有ica基因座存在時，在環(huán)境因素的影響下菌株可以形成生物膜，但形成能力很弱;bhp的表達受葡萄糖調(diào)控，在葡萄糖存在時，可誘導(dǎo)表達引起菌體的凝集[4]。因此可以說bhp具有彌補PIA缺乏而形成生物膜的功能。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)有1株菌同時含有aap基因和bhp基因，而其生物膜形成為強陽性，這也在一定程度上對此結(jié)論進行了驗證。

3.2 表皮葡萄球菌生物膜形成機制

影響生物膜形成的因素有多種，可將按其形成是否依賴胞間多糖粘附素形成機制可分為兩類:ica依賴型和ica非依賴型[11]。ica依賴型的形成機制是指生物膜的形成需要于ica基因座的編碼產(chǎn)物PIA得，而ica非依賴型的形成機制是指生物膜的形成過程沒有ica基因座編碼產(chǎn)物的介導(dǎo)，是由其它眾多調(diào)控因子共同作用形成的。目前研究較多的ica非依賴型的生物膜形成相關(guān)基因有聚集相關(guān)蛋白(accumulation－associated protein，aap)、生物膜相關(guān)蛋白類似物(biofilm－associated protein homologue protein，bhp)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(fibrinogen binding protein，fbe)、自溶素E(autolysin E，atlE)和葡萄球菌附屬調(diào)節(jié)蛋白A(staphylococcal accessory regulator A，sarA)等[11－15]。

有學(xué)者證明ica非依賴型的生物膜可能是一種在抗生素壓力下形成的“不完全”生物膜[16]。在本實驗中，雖然檢測出22株生物膜形成菌株，但與含有ica基因座的表皮葡萄球菌AICC35984相比，形成的生物膜粘附力不夠。這也說明ica基因座編碼產(chǎn)生的PIA是生物膜形成的重要物質(zhì)，能使細菌牢固粘附在固相表面上。

從本實驗的研究結(jié)果看，目前新疆南疆地區(qū)奶牛場奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌的生物膜形成機制均為ica非依賴型。由于所選的基因有限，在分離的菌株中有一些能夠形成生物膜，但卻未能擴增出所選的5個基因之一。另一方面，仍有50%以上的菌株能夠擴增出所選基因，但其生物膜形成卻表現(xiàn)為陰性。這些結(jié)果的出現(xiàn)更進一步說明了ica非依賴型生物膜形成機制的復(fù)雜性，還存在其他眾多的調(diào)控機制調(diào)控生物膜的形成。這種復(fù)雜性給新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜感染的防制帶來困難。

綜上所述，表皮葡萄球菌生物膜的形成是一個非常復(fù)雜的過程，闡明生物膜形成機制，制定針對生物膜感染的有效措施，可能是新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎防制的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎的防制奠定了理論基礎(chǔ)。

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