小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的原核表達(dá)與純化

陳立瑾，田利源，李秀麗，汪 莉，王玉民，陳樹(shù)林

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 海淀 100071）

附睪是連接睪丸和輸精管的細(xì)長(zhǎng)管道，哺乳動(dòng)物的精子在睪丸中生成后，并沒(méi)有達(dá)到功能上的成熟。在穿過(guò)附睪時(shí)，與附睪中的液體相互作用，才逐步獲得授精的能力［1-3］。附睪基因功能的研究已經(jīng)成為生殖生物學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)。

本文研究的fam12b基因?qū)儆谛∈蟾讲G基因，在小鼠出生后不久即有表達(dá)，且可以分泌到附睪腔中［4］。近來(lái)的研究將fam12b歸為RNase A超家族的新成員［5-6］。大部分RNase A基因在大鼠、小鼠和人中含有同源基因［7］，RNase A超家族成員具有多種生物學(xué)功能：可以降解核酸、抗菌、抗病毒［8］、抑制腫瘤生成［9］、參與哺乳動(dòng)物內(nèi)源宿主防御［10-11］等。fam12b基因在小鼠附睪中高表達(dá)［4］，我們推測(cè)它可能參與了精子成熟的過(guò)程。目前還未見(jiàn)研究報(bào)道Fam12b蛋白的功能。

本試驗(yàn)中我們克隆了小鼠附睪基因fam12b，串聯(lián)后連入pET28（a）載體，于大腸桿菌 Rosetta（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度融合蛋白，為進(jìn)一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡C57雄鼠由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

表達(dá)載體pET28（a）由國(guó)家儀器分析中心張學(xué)敏實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌 DH5α、Rosetta（DE3），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

試劑：動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，均購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Nde I、EcoRⅠ、HindⅢ、EcoR V、T4DNA連接酶，購(gòu)自NEB生物公司；Ni-NTA親和柱，購(gòu)自Qiagen公司；PCR引物合成及測(cè)序均由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 目的基因fam12b的獲得 提取8周齡C57雄鼠附睪總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。參照GenBank公布的序列（NM＿203508.1），用信號(hào)肽分析軟件（http：／／bmbpcu36.leeds.ac.uk／prot-analysis／signal）分析出信號(hào)肽序列，將去掉信號(hào)肽的序列擴(kuò)增出來(lái)。擴(kuò)增目的基因的兩種片段1和2，在片段1的5端引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，在3端引入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)；在片段2的5端引入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)，3端引入Hin dⅢ酶切位點(diǎn)。其中片段1不含終止密碼子，片段2含有終止密碼子。

設(shè)計(jì)引物如下（下劃線為酶切位點(diǎn)）：

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 片段1用NdeⅠ和Eco RⅠ雙酶切，片段2用Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切，原核表達(dá)載體pET28（a）用Hin dⅢ、NdeⅠ雙酶切，產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用Hin dⅢ和Eco R V雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切正確的質(zhì)粒由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4h。收集1mL菌液，離心去上清加入溴酚藍(lán)緩沖液懸浮沉淀，處理后進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)。

1.5 Western-blot鑒定目的蛋白 將1.4中菌體裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至0.22μm的PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1h，以His標(biāo)簽抗體孵育1h，TBST洗滌，羊抗鼠IgG-HRP孵育1h，TBST洗滌，加入HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物后在暗室顯影。

1.6 純化融合蛋白［12］將誘導(dǎo)成功的陽(yáng)性菌液轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)液中，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6，加入IPTG誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)4h。離心收集菌體細(xì)胞，-20℃凍存。IPTG誘導(dǎo)前后的菌液各取1mL，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

取出凍存的菌體，按照QIAGEN蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，向10mL變性蛋白緩沖液B（pH值8.0）中加入500μL蛋白酶抑制劑溶液，混勻后加至菌體沉淀，室溫放置1h。然后離心取上清加至Ni-NTA蛋白純化柱，用變性蛋白緩沖液C（pH值6.3）洗滌2次后用變性蛋白緩沖液E（pH值4.5）洗脫3次。收集各步驟中流出的液體，SDS-PAGE檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約在380bp處有特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 fam12b基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組載體的鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Hin dⅢ、Eco R V雙酶切鑒定，預(yù)期片段大小分別為2126bp與3969bp的片段，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符（圖2）。測(cè)序后顯示成功獲得序列完整且讀碼框正確的表達(dá)載體。

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將1.4中處理的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，在約31kDa處檢測(cè)到蛋白表達(dá)的條帶。Western-blot鑒定顯示出在該位置處有特異性條帶（圖3）。

2.4 融合蛋白的親和純化 重組蛋白帶有His標(biāo)簽，用Ni-NTA蛋白純化柱親和純化，收集各步驟中的液體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，如圖4。

3 討論

雄性哺乳動(dòng)物的生殖道不容易被感染，很重要的一個(gè)原因是附睪上皮細(xì)胞會(huì)分泌一些蛋白，其中有些蛋白具有抗菌作用，保護(hù)精子可以順利通過(guò)生殖道［13］，精子在穿過(guò)附睪的過(guò)程中逐步成熟［14］。我們前期的工作用fam12b的單個(gè)基因連入pET28（a）載體，摸索了不同梯度的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度，但是均未檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)；只有當(dāng)兩個(gè)相同的基因串聯(lián)后，才能以融合蛋白的形式表達(dá)出來(lái)，我們推測(cè)該蛋白可能具有一定的抗菌能力，兩個(gè)基因串聯(lián)表達(dá)后，改變了天然存在蛋白的空間構(gòu)象，進(jìn)而干擾了蛋白的抗菌能力，故可以在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)出來(lái)。另外，小分子蛋白的免疫原性較小，采用串聯(lián)表達(dá)的方式可以增加該蛋白的免疫原性，便于制備抗體用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

4 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)利用原核表達(dá)體系表達(dá)了小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的融合蛋白，并獲得純度較好的蛋白，為制備其多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

［1］Cooper T G.Interactions between epididymal secretions and spermatozoa［J］.J Reprod Fertil Suppl，1998，53：119-136.

［2］Brooks D E，Tiver K.Localization of epididymal secretory proteins on rat spermatozoa［J］.J Reprod Fertil，1983，69（2）：651-657.

［3］Jones R.Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis［J］.J Reprod Fertil Suppl，1998，53：73-84.

［4］Oh J，Lee J，Woo J M，et al.Systematic identification and integrative analysis of novel genes expressed specifically or predominantly in mouse epididymis［J］.BMC Genomics，2006，7：314.

［5］Christiane K.Human epididymis-specific gene expression［J］.Anir-Anhp，2007，9：25-42.

［6］Thimon V，Koukoui O，Calvo E，et al.Region-specific gene expression profiling along the human epididymis［J］.Molecular Human Reproduction，2007，13：691-704

［7］Cho S，Beintema J J，Zhang J.The ribonuclease A superfamily of mammals and birds：identifying new members and tracing evolutionary histories［J］.Genomics，2005，85（2）：208-220.

［8］Hooper L V，Stappenbeck T S，Hong C V，et al.Angiogenins：a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity［J］.Nat Immunol，2003，4（3）：269-273.

［9］Ardelt W，Mikulski S M，Shogen K.Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos.Homology to pancreatic ribonucleases［J］.J Biol Chem，1991，266（1）：245-251.

［10］Dyer K D，Rosenberg H F.The RNase a superfamily：generation of diversity and innate host defense［J］.Mol Divers，2006，10（4）：585-597.

［11］Rosenberg H F.RNase A ribonucleases and host defense：an evolving story［J］.J Leukoc Biol，2008，83（5）：1079-1087.

［12］田利源，李秀麗，汪莉，等.小鼠附睪分泌蛋白Spink12的原核表達(dá)與純化［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（2）：197-200.

［13］張永蓮.附睪功能基因組研究進(jìn)展［J］.中國(guó)科學(xué)院院刊，2002，17（1）：34-36.

［14］Hall S H，Hamil K G，F(xiàn)rench F S.Host defense proteins of the male reproductive tract.［J］.J Androl，2002，23（5）：585-597.