NGAL、MMP-9在食管癌中的表達及其臨床意義

劉文健， 王茂生

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)之一，其病因及發(fā)病機制錯綜復雜，至今尚未明確。人中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的成員之一，由Kjeldsen等在中性粒細胞的特殊顆粒中首先發(fā)現(xiàn)的25 kD的糖蛋白［1］。有研究表明NGAL能調節(jié)基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性，并可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展特別是腫瘤的浸潤轉移等過程［2-3］。MMP-9屬于鋅肽酶超家族成員之一，能降解對腫瘤轉移起屏障作用基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，可能在腫瘤的侵襲轉移中發(fā)揮重要作用［4］。有關MMP-9與食管癌浸潤、轉移關系雖有部分文獻報道，但NGAL與食管癌浸潤、轉移關系的研究，迄今國內(nèi)外均未見報道。本文旨在探討NGAL與MMP-9在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并探討兩者的相關性，尋找食管癌早期診斷和判斷預后的新指標。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集茂名市人民醫(yī)院2006年1月至2010年12月食管癌手術切除標本58例，其中男性34例，女性24例，年齡45～88歲，平均年齡(61.6±4.5)歲;病理證實均為食管癌，其中鱗癌48例、腺癌10例;高、中、低分化分別為13、24、21例;伴有淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者20例。所有患者術前均未行放化療及其他治療史。另選取18例活檢正常食管組織。全部標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，以備免疫組化使用。

1.2 主要實驗試劑 SABC免疫組化試劑盒、兔抗NGAL多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、DAB顯色劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 免疫組化及 HE染色 采用 ABC法，兔抗NGAL多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體用PBS稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶300，每個標本蠟塊取4張切片，分別標上A、B、C、D(A為檢測NGAL的表達，B為檢測MMP-9的表達，C為HE染色，D為陰性對照)脫蠟，抗原經(jīng)高溫高壓修復處理，抗原修復液為枸櫞酸鹽緩沖液，PBS沖洗，滴加一抗，4℃濕盒過夜，滴加生物素化通用型二抗，經(jīng)DAB染色，蘇木素復染后，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。嚴格按照說明書步驟操作。顯微鏡觀察，以胞漿有棕色顆粒者為陽性細胞。在400倍光鏡下選取表達區(qū)域攝像，用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統(tǒng)對收集圖像進行處理。

1.4 結果判斷 檢測均以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。鏡下觀察腫瘤細胞胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用Garvia的判定方法評判MMP-9和NGAL表達的強度:(1)細胞胞質著色深淺，基本不著色為0，淺棕色為1，深棕色為2。(2)陽性著色細胞比例，＜20%為1，20% ～50%為2，＞50%為3。(3)以上2項相加，2為(+)，3～4為(++)，＞4為(+++)。(4)未著色細胞質為(－)。(5)≥3為高表達，＜3為低表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩樣本率的比較及兩蛋白之間的相關性采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管癌與正常食管組織中NGAL與MMP-9的表達 由表1、圖1～9可見NGAL與MMP-9在食管癌中的表達明顯高于其在正常食管組織中的表達，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 NGAL與MMP-9在食管癌中的表達與臨床病理指標的關系 由表2可見NGAL與MMP-9在食管癌中的表達與患者的性別、年齡、組織學類型無關(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤、分化程度、淋巴結轉移密切相關(P ＜0.05)。

2.3 NGAL與MMP-9在食管癌中表達的相關性由表3可見NGAL和MMP-9兩者都是陰性的有8例，一為陰性一為陽性17例，兩者均為陽性33例;統(tǒng)計學分析顯示NGAL和MMP-9在食管癌中的表達存在關聯(lián)性(r=0.572，P ＜0.05)。

表1 不同食管癌組織中NGAL、MMP-9表達情況

圖1～3 分別為正常食管組織、鱗癌、腺癌的HE染色

圖4～6 分別為NGAL在正常食管組織、鱗癌、腺癌中的表達

圖7～9 分別為MMP-9在正常食管組織、鱗癌、腺癌中的表達

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌，其發(fā)病率和死亡率各國差異很大，我國是食管癌高發(fā)地區(qū)之一。浸潤和轉移是食管癌晚期致死的主要原因之一。惡性腫瘤的浸潤和轉移是以細胞外基質和基底膜降解為關鍵環(huán)節(jié)。MMP-9可特異性地降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原，促進新生血管的形成，參與腫瘤細胞的侵襲轉移［4］。MMP-9在食管癌中呈現(xiàn)過表達并在浸潤轉移中扮演著重要角色［5］。國內(nèi)劉威、王憲遠等研究認為，血漿MMP-9的水平與腫瘤的侵襲能力呈正相關［6-7］。有研究顯示NGAL基因可能是人類的一種新的癌基因，但其在腫瘤中的確切功能尚不清楚。NGAL與食管癌、甲狀腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌和白血病等其他惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其預后有著密切關系［3-8］，是一種具有多功能的25 kD糖蛋白，可通過二硫鍵結合MMP-9 并調節(jié)其活性［9］。Kubben、Zhang 等［10-11］研究表明NGAL/MMP-9的水平及其基因表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移呈正比關系。李恩明等［12］研究認為，NGAL基因在腫瘤中的作用可能是調節(jié)保護MMP-9，并與之形成異源二聚體(NGAL/Pro-MMP-9)，并以此促進惡變細胞的浸潤轉移。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)NGAL、MMP-9在食管癌組織中的表達明顯增高，且二者的表達存在密切的相關性，在食管癌的發(fā)病過程中可能存在協(xié)同作用。食管癌組織中NGAL與MMP-9的表達強度與食管癌的分化程度、浸潤及轉移關系密切，二者高表達預示著腫瘤有較強的侵襲力和較差的預后，有望成為食管癌診斷的新的分子指標并對食管癌的轉移及預后有著重要的參考意義。但兩者具體的協(xié)同機制尚有待于進一步研究。

表2 NGAL、MMP-9表達與食管癌患者臨床病理指標的關系

表3 食管癌中NGAL與MMP-9表達的相關性

［1］ Kjeldsen L，Johnsen AH，Sengelv H，et al.Isolation and prima

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［2］ Sousa MM，do Amaral JB，Guimares A，et al.Up-regulation of the extracellular matrix remodeling genes，biglycan，neutrophil gelatinase-associated lipocalin，and matrix metalloproteinase-9 in familial amyloid polyneuropathy［J］.FASEB J，2005，19(1):124-126.

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［12］ 李恩民，許麗艷，蔡唯佳，等.SHEEC食管癌細胞中NGAL基因的功能［J］.生物化學與生物物理學報，2003，35(3):247-254.