自體DC疫苗對惡性黑色素瘤術(shù)后患者免疫功能的影響

姚宇鋒， 賴婭娜， 陳環(huán)球

惡性黑色素瘤(Maligant Melanoma，MM)是指來源于神經(jīng)嵴的黑色素細胞在免疫缺陷、遺傳因素及多種理化因素等影響下惡變而形成的一種惡性腫瘤。是一種高度惡性腫瘤，對放化療不敏感，手術(shù)治療是其主要治療手段。近年來用樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)疫苗治療晚期惡性黑色素瘤的研究甚多［1-2］，但是國內(nèi)外尚缺少DC疫苗治療無遠處轉(zhuǎn)移的可根治手術(shù)MM的資料。為此，我們對2008年1月至2009年12月我科收治的12例肢體MM患者根治術(shù)后進行負載腫瘤細胞抗原的DC疫苗治療，并與同期30例未接受DC疫苗治療的肢體MM患者進行比較分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入42例進展期(Ⅱ、Ⅲ期)肢體MM患者，男22例，女20例，年齡33～67歲，中位年齡56.8歲。42例患者均行根治性手術(shù)治療并經(jīng)病理學證實為MM，影像學檢查排除遠處轉(zhuǎn)移，KPS≥60分;血常規(guī)、肝腎功能、心肺功能基本正常。其中12例簽署知情同意書接受常規(guī)免疫治療聯(lián)合DC疫苗治療，其余30例患者僅接受常規(guī)免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 熱休克凋亡MM細胞抗原負載的DC疫苗的制備和回輸 按參考文獻［3］方法進行DC疫苗的制備。按參考文獻［4］方法進行DC疫苗的回輸，每周注射1次，劑量為4×106細胞/次，共注射4次，部分患者注射5～8次。注射前按2005版《中華人民共和國藥典》第三部規(guī)定的方法進行無菌和內(nèi)毒素檢測合格。

1.2.2 治療方法 常規(guī)組術(shù)后只接受IL-2/IFNα-2b治療方案。IL-2 200萬U肌肉注射，qod;IFNα-2b 300萬U肌肉注射，qod;1個月為1個療程。IL-2及IFNα-2b間隔應(yīng)用。治療組在行上述方案治療的進行DC疫苗注射，方法和劑量同前。

1.2.3 免疫學指標觀察 分別在DC疫苗治療前和結(jié)束1周后用流式細胞儀檢測外周血 CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴細胞亞群、自然殺傷(nature kill，NK)細胞的比率及 IFN-γ+CD8+T細胞數(shù)量［5］，ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)檢測血清 IL-2、IL-10、IL-12、TNF-α 和 IFN-γ 的水平。DTH試驗:DC免疫治療結(jié)束1周時進行DTH(delayed type hypersensitivity)試驗，用l mL青霉素試驗注射器吸取0.2 mL制備好的DC懸液，于一側(cè)上肢前臂內(nèi)側(cè)行皮內(nèi)注射，同時在對側(cè)前臂內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水作為對照。注射后48～72 h內(nèi)通知患者觀察注射部位有無紅腫及硬，直徑大于5mm者判斷為DTH試驗陽性。

1.2.4 安全性評價 在DC輸注后30min及24 h觀察局部及全身急性毒性反應(yīng)并作及時處理，直至毒性反應(yīng)消失或接受其他治療。整個治療過程中參照國家規(guī)定的《抗腫瘤藥物急性與亞急性毒性反應(yīng)分度級標準》觀察患者是否出現(xiàn)不良反應(yīng)并且動態(tài)監(jiān)測患者血液細胞學和肝腎功能變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 免疫指標變化

聯(lián)合DC治療組在DC免疫治療后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及 NK 細胞比率較治療前明顯升高(P＜0.05)，且明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)(表1);同時DC治療后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均較治療前及常規(guī)治療組顯著上升(P＜0.05)(表2)。另外對常規(guī)免疫治療聯(lián)合DC組12例患者進行了IFN-γ+CD8+細胞檢測和DTH試驗，7例患者治療后IFN-γ+CD8+T細胞數(shù)量升高2倍以上，其中5例治療后DTH試驗呈陽性反應(yīng)。

2.2 不良反應(yīng)

表1 兩組治療前后T淋巴細胞亞群及NK細胞比率的變化(x ± s，%)

表2 兩組治療前后細胞因子的變化(±s，pg/mL)

表2 兩組治療前后細胞因子的變化(±s，pg/mL)

a:與DC治療前比較，P＜0.05;b:與常規(guī)組治療后比較，P＜0.05

常規(guī)治療組常規(guī)治療聯(lián)合DC組指標治療前 治療后IL-2 33.86 ±14.34 38.38 ±13.23 34.13 ±12.61 54.86 ±16.43ab IL-10 41.78 ±13.27 43.82 ±12.35 42.87 ±13.64 44.96 ±16.32 IL-12 24.54 ±6.82 32.82 ±6.59 22.80 ±5.53 73.90 ±15.68ab IFN-γ 45.73 ±13.27 49.82 ±12.35 45.87 ±13.64 69.96 ±16.32ab TNF-α 21.07 ±6.63 22.74 ±6.59 21.80 ±5.53 75.90 ±15.63治療前 治療后ab

常規(guī)治療聯(lián)合DC組的12例患者，皮下注射后30 min內(nèi)均未出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛、寒戰(zhàn)、高熱等不良反應(yīng)，3例患者在整個疫苗治療過程中出現(xiàn)低熱反應(yīng)，未予特殊處理后恢復，4例患者出現(xiàn)注射局部紅腫、硬結(jié)，給予對癥處理后，紅腫消失、局部硬結(jié)未出現(xiàn)擴大現(xiàn)象。所有患者均未出現(xiàn)嚴重的血液細胞學、肝腎功能的變化。上述結(jié)果顯示DC疫苗注射是安全的，無明顯毒副作用。

3 討論

目前手術(shù)治療仍是治療MM最行之有效的方法。由于MM對放療、化療不敏感，病死率仍很高。近年來，生物治療在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用技術(shù)日趨成熟，如白介素-2(IL-2)，干擾素(IFN)等。而DC免疫治療在惡性黑色素瘤治療中的應(yīng)用也越來越受到人們的重視。影響DC免疫治療的因素很多，其中與MM臨床預(yù)后有關(guān)的一個重要因素就是DC負載的腫瘤抗原［6］。DC疫苗的抗原負載體系有多種不同形式，如單個腫瘤抗原肽、混合腫瘤抗原多肽、腫瘤細胞裂解液、腫瘤細胞核酸等。與上述抗原制備方式不同的是，本研究采用熱休克方式誘導腫瘤細胞凋亡，制備自體腫瘤抗原。由于熱休克可以誘導腫瘤細胞高表達熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，DC表面表達多種HSP受體(如CD91，CD40，TLR2/4或LOX1)，通過受體介導的內(nèi)吞機制將使DC高效地攝取 HSPs-多肽復合物抗原，用富含HSPs的腫瘤細胞進行抗原負載可提升DC疫苗的效率［7］。本研究采用熱休克凋亡的自體腫瘤細胞制備抗原，在避免腫瘤抗原缺失造成免疫逃避的同時提高DC疫苗的免疫原性，研究其治療MM的臨床應(yīng)用價值。

外周血 中 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例、NK細胞比率的變化是反映人體特異性和非特異性免疫功能的重要指標，其中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例反映機體特異性免疫功能，NK細胞反映機體非特異性細胞免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，12例患者在經(jīng)過DC 疫苗治療后 CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及NK細胞比率明顯升高，說明DC疫苗治療能夠提高MM患者的特異性和非特異性免疫功能，對于增強患者術(shù)后的抗腫瘤功能具有重要意義。

IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α 在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，如 IL-2、IL-12刺激 NK細胞或CTL的殺瘤活性，IFN-γ具有較強的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，TNF-α可直接造成腫瘤細胞的凋亡，其中IL-2、IL-12 和 IFN-γ 均為 Thl細胞直接分泌［7］。腫瘤患者手術(shù)前后都可出現(xiàn)Thl反應(yīng)向Th2的漂移(Th1/Th2 漂移)，機體出現(xiàn) Thl弱勢［8-9］，使機體的免疫功能進一步降低。本研究顯示自體DC免疫治療后，Th1 類細胞因子 IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α的水平明顯升高，而Th2型細胞因子IL-10的變化沒有統(tǒng)計學意義，提示DC疫苗能誘導增強體內(nèi)抗腫瘤細胞免疫，可激發(fā)腫瘤患者的Th1型免疫反應(yīng)，有利于殘余微小病灶的清除。有文獻報道DC免疫治療后DTH陽性及特異性T細胞免疫應(yīng)答與患者的生存期有一定的相關(guān)性［10］。在本研究中，12例常規(guī)治療聯(lián)合DC組患者有7例患者治療后IFN-γ+CD8+T細胞數(shù)量升高2倍以上，其中5例患者治療后DTH試驗呈陽性反應(yīng)。

毒副作用的觀察提示，在DC疫苗治療過程中，僅少數(shù)患者出現(xiàn)低熱反應(yīng)及輕微的瘤苗注射局部的紅腫、硬結(jié)，沒有觀察到嚴重的局部反應(yīng)及血液細胞學、肝腎功能方面的明顯變化。說明通過熱休克腫瘤細胞后負載DC制備的DC疫苗以及疫苗的治療方式對于患者是相對安全的，可以在臨床推廣應(yīng)用?？傊?，我們的研究通過DC疫苗的免疫學效應(yīng)證實，負載腫瘤細胞抗原的DC疫苗對于惡性黑色素瘤根治術(shù)后的輔助治療是安全有效的。但是評價DC輔助治療是否有效的最終指標是無病生存期和總生存期，因此我們將繼續(xù)隨訪DC輔助治療對于生存期的影響，以明確其臨床價值。

［1］ Redman BG，Chang AE，Whitfield J，et al.Phase Ib trial assessing autologous，tumor-pulsed dendritic cells as a vaccine administered with or without IL-2 in patients with metastatic melanoma［J］.J Immunother，2008，31(6):591-598.

［2］ O'Rourke MG，Johnson MK，Lanagan CM，et al.Dendritic cell immunotherapy for stage IV melanoma［J］.Melanoma Res，2007，17(5):316-322.

［3］ 朱玉蘭，錢科卿，高海燕，等.熱休克凋亡乳腺癌細胞負載的DC體內(nèi)激發(fā)Thl型免疫反應(yīng)［J］.南京醫(yī)科大學學報，2008，28(1):113-116.

［4］ 邵純，宋潔，徐志萍.DC疫苗埋藏式多點皮內(nèi)注射在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用及臨床觀察［J］.護士進修雜志，2008，23(7):649-650.

［5］ Brossart P，Wirths S，Stuhler G，et al.Induction of cytotoxic T-lymphocyte response in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells［J］〗.Immunibiology，2000，96(9):3102-3108.

［6］ Engell-Noerregaard L，Hansen TH，Andersen MH，et al.Review of clinical studies on dendritic cell-base vaccination of patients with malignant melanoma:assessment of correlation between clinical response and vaccine parameters［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(1):1-14.

［7］ Shi H，Cao T，Connlly JE，et al.Hyperthermia enhance CTL cross-priming［J］.J Immuno，2006，176(4):2134-2141.

［8］ Hadden JW.Immunodeficiency and cancer:prospects for correction［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(8):1061-1071.

［9］ 沈洪彥，孫治君.Th1/Th2細胞與腫瘤復發(fā)［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006，13(4):490-492.

［10］ López MN，Pereda C，Segal G，et al.Prolonged survival of dendritic cell-vaccinated melanoma patients correlates with tumorspecific delayed type IV hypersensitivity response and reduction of tumor growth factor beta-expressing T cells［J］.J Clin Oncol，2009，27(6):945-952.