RP-HPLC法測(cè)定北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素的含量

劉靜平，王永春，李勇，賈景明（.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川市750004；.沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，沈陽市 036；3.沈陽藥科大學(xué)，沈陽市 006）

北蟲草Cordycepsmilitaris（L.）Link又名蛹蟲草，是真菌門子囊菌亞門肉座目麥角菌科蟲草屬的模式種[1]，是我國名貴中藥材之一，主要分布于吉林、遼寧、陜西、河北等地[2]。作為我國中藥寶庫的瑰寶，它具有提高人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種醫(yī)療和保健作用。

蟲草素（3′-脫氧腺苷，3′-Deoxyadenosine）亦稱蟲草菌素（Cordycepin），是一種核苷類抗生素。蟲草素的分子式為C10H13N5O3，相對(duì)分子質(zhì)量為251，熔點(diǎn)為230～231℃，最大吸收波長為259 nm[3]。最初蟲草素是從北蟲草培養(yǎng)物中分離得到的[4]，具有顯著的藥理活性[5]。筆者改進(jìn)了蟲草素的測(cè)定方法，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素的含量，并與野生北蟲草做了對(duì)比試驗(yàn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC儀，含LC-10ATvp泵、SPD-10ATvp紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；AT-330柱溫箱（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；FA2104N電子天平（上海民橋醫(yī)療器械有限公司）；KH2200B超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：80W）。

1.2 試藥

水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈為色譜純；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司，含量≥99%）。

1.3 樣品

北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物（韓國東亞大學(xué)，批號(hào)：DAU-Cm-Kangwon-1）；野生北蟲草藥材由韓國東亞大學(xué)提供，由沈陽藥科大學(xué)賈景明教授鑒定為北蟲草C.militaris（L.）Link，標(biāo)本存放于沈陽藥科大學(xué)標(biāo)本館（標(biāo)本號(hào)：200608210-A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIAMONSIL-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-甲醇（5∶90∶5）；流速：0.8m L·min-1；檢測(cè)波長：259 nm；柱溫：40℃。在此條件下，蟲草素的保留時(shí)間為14min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品；B.北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物；C.野生北蟲草藥材Fig 1 HPLC chromatogram s A.cordycepin standard；B.fermented C.militaris；C.w ild materials of C.militaris

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品3.2mg，加入50%乙醇溶液定容至25m L，混勻，即得（每1m L溶液含蟲草素0.128mg）。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物0.2 g，溶于5m L 50%乙醇溶液中，超聲提取30min，補(bǔ)足失重，先經(jīng)濾紙粗濾，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得。用微量進(jìn)樣器精密吸取10μL濾液進(jìn)樣。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液4、2、1.2、0.8、0.4、0.2m L，置10m L容量瓶中，以50%乙醇溶液定容，混勻，制得濃度分別為51.20、25.60、15.36、10.24、5.12、2.56 μg·m L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）作線性回歸，得回歸方程為Y＝23 979X+16 085（r＝0.999 8，n＝6）。結(jié)果表明，蟲草素檢測(cè)濃度在2.56～51.20 μg·m L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度為25.60μg·m L-1的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果，蟲草素的峰面積平均值為629 947，RSD＝1.34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物各0.2 g，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，準(zhǔn)確吸取10μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，6份樣品中蟲草素的峰面積平均值為158 041，平均含量為0.148mg·g-1，RSD＝1.76%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取0.2 g北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10 h測(cè)定。結(jié)果，蟲草素的峰面積平均值為159 213，RSD＝2.7%（n＝6），表明北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物供試品溶液中蟲草素在提取后10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品6份，每份0.2 g，精密加入適量的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量和加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 野生北蟲草藥材與北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素的含量測(cè)定

取野生北蟲草藥材與北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果，野生北蟲草和北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素含量分別為0.105、0.148mg·g-1。

3 討論

試驗(yàn)比較了多種流動(dòng)相，最后選擇乙腈-水-甲醇（5∶90∶5）作流動(dòng)相，分離度尚佳，保留時(shí)間也較合適，色譜峰峰形較好，使定量分析的準(zhǔn)確性得到提高。

從測(cè)定結(jié)果來看，北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素的含量高于野生北蟲草藥材，為今后尋找北蟲草的替代品提供了理論依據(jù)。

北蟲草發(fā)酵培養(yǎng)物中含有豐富的蛋白、糖類以及多種微量元素和維生素，藥理作用研究顯示其具有明顯的鎮(zhèn)靜、耐缺氧、抗炎等作用，而且毒性很低[6]，重要活性成分蟲草素含量較高，加之是大規(guī)模人工培養(yǎng)，產(chǎn)量穩(wěn)定，所以是很好的中藥材資源，具有開發(fā)利用前景。

[1]馬吳偉，潘蘇華.蛹蟲草研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008，4（11）：148.

[2]施 英，吳娛明，廖森泰，等.蛹蟲草藥理作用研究進(jìn)展[J].廣東蠶業(yè)，2006，40（3）：43.

[3]抗菌素生物理化特性編寫組.抗菌素生物理化特性（第1分冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：983.

[4]汪 宇，于榮敏，汪曉寧.利用蟲草屬藥用真菌提取分離核酸類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2004，15（1）：53.

[5]伍小燕，黃權(quán)芳.柞蠶蛹蟲草提取物對(duì)模型大鼠膜性腎炎的保護(hù)作用研究[J].中國藥房，2009，20（33）：2 579.

[6]陳桂寶，羅梅初，劉實(shí)晶，等.蛹蟲草的藥理作用研究[J].中草藥，1997，28（7）：414.