甘肅當(dāng)歸炮制前后HPLC特征圖譜及阿魏酸含量測定研究

張 永，高昌琨，嚴(yán)安定（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥市 230022）

當(dāng)歸作為常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，已有2 000多年的藥用歷史。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效[1]，主產(chǎn)于甘肅、云南、陜西、四川等地。甘肅是當(dāng)歸的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量約占全國總產(chǎn)量的90%。甘肅當(dāng)歸以產(chǎn)量高、質(zhì)量優(yōu)而享有盛譽，特別是“岷歸”更是馳名古今、蜚聲海外。由于當(dāng)歸的質(zhì)量除了受土壤、光照、氣候等環(huán)境因素影響外，還與藥材的品種、產(chǎn)地、采收加工等因素密切相關(guān)，因此不同產(chǎn)地的當(dāng)歸質(zhì)量各不相同[2]；即使同一產(chǎn)地的當(dāng)歸，其質(zhì)量也有一定的差異[3]。而且，當(dāng)歸在臨床上常以炮制品入藥，不同的炮制過程對其質(zhì)量的影響也各不相同[4]。因此，有必要建立一種評價當(dāng)歸炮制過程質(zhì)量變化的方法，以全面評價當(dāng)歸不同炮制品的質(zhì)量，保證飲片療效。

本研究中，筆者以甘肅3個主產(chǎn)地的當(dāng)歸為研究對象，利用特征圖譜技術(shù)[5]建立了甘肅當(dāng)歸的高效液相色譜（HPLC）特征圖譜分析方法，并在相同色譜條件下對炮制前后甘肅當(dāng)歸中阿魏酸的含量進(jìn)行了測定，建立了更加全面合理的中藥飲片鑒別和質(zhì)量評價方法。

1 儀器與試藥

LC-20AB HPLC儀，包括DGU-20A3在線脫氣機(jī)、SIL-20A自動進(jìn)樣器、SPD-M 20A檢測器、CTO-20A柱溫箱和Class-VP色譜工作站（日本島津公司）；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器（功率：250W，頻率：40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

甲醇、乙腈為色譜純（美國Merck公司），其他試劑均為分析純；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%）；收集3個主產(chǎn)地當(dāng)歸藥材各50 kg，分別產(chǎn)自甘肅漳縣（批號：091128）、甘肅渭源（批號：090606）、甘肅岷縣（批號：090605），均由合肥和義堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸A.sinensis（Oliv）Diels的干燥根，標(biāo)本保存于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，標(biāo) 本編號 分別為 AMR-091128、AMR-090606、AMR-090605。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸的炮制加工

不同產(chǎn)地的甘肅當(dāng)歸樣品均由合肥和義堂中藥飲片有限公司在生產(chǎn)條件下加工炮制成當(dāng)歸片和酒當(dāng)歸。取不同產(chǎn)地的當(dāng)歸藥材，清洗后用水淋洗軟化，用切藥機(jī)切成1.5mm的薄片，置烘箱中50℃干燥4 h至干，即得當(dāng)歸片；取當(dāng)歸片，按100 kg當(dāng)歸片加10 kg黃酒的比例加黃酒拌勻、潤透，然后置炒藥機(jī)中95℃炒制20m in至干，顏色呈深黃棕色，即得酒當(dāng)歸。具體炮制加工流程見圖1。

圖1 當(dāng)歸炮制加工過程示意圖Fig 1 Flow chartof A.sinensis processing

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：35 ℃；流速：1.0m L·min-1；檢測波長：254 nm；流動相：乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30min，5%～18%A；30～65m in，18%～38%A；65～75min，38%～50%A；75～85 min，50% ～56%A；85～95 min，56%A；95～110 min，56%～65%A；110～120 min，65%～85%A；120～125 min，85%～5%A）；進(jìn)樣量：10μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，置于5m L量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.000mg·m L-1的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏備用。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取當(dāng)歸樣品粉末1.0 g，置100m L具塞錐形瓶中，加甲醇30m L，密塞，超聲提取30m in，取出放冷，用濾紙濾過，藥渣連同濾紙放回錐形瓶中，再加甲醇30m L，同法再超聲提取1次，放冷，用濾紙濾過，合并2次濾液，減壓蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10m L容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣前以0.45μm微孔濾膜過濾。

2.5 甘肅當(dāng)歸炮制前后特征圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗 取甘肅渭源當(dāng)歸供試品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以阿魏酸峰為標(biāo)準(zhǔn)峰，計算得各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.118%，相對峰面積的RSD均＜2.13%，表明方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取甘肅渭源當(dāng)歸供試品溶液適量，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.109%，相對峰面積的RSD均＜2.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取甘肅渭源當(dāng)歸樣品適量，按“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.138%，相對峰面積的RSD均＜5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 特征峰的指認(rèn) 精密吸取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μL，注入色譜儀，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，確定在此色譜條件下阿魏酸的位置（圖2）；同時，以甲醇為空白溶劑進(jìn)樣5μL，確認(rèn)空白溶劑中相應(yīng)位置沒有干擾峰存在。

圖2 阿魏酸的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogramsof ferulic acid

2.5.5 甘肅當(dāng)歸炮制前后特征圖譜的測定 分別精密稱取甘肅漳縣當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸、甘肅渭源當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸、甘肅岷縣當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸樣品適量，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，建立各樣品的特征圖譜，詳見圖3。

圖3 甘肅當(dāng)歸炮制前后HPLC特征圖譜A.漳縣當(dāng)歸片；B.漳縣酒當(dāng)歸；C.渭源當(dāng)歸片；D.渭源酒當(dāng)歸；E.岷縣當(dāng)歸片；F.岷縣酒當(dāng)歸；1～8.共有峰；1.阿魏酸Fig 3 HPLC specific chromatogram s of crude and processed A.sinensis A.crude A.sinensis from Zhangxian；B.processed A.sinensis from Zhangxian；C.crude A.sinensis from Weiyuan；D.processed A.sinensis from Weiyuan；E.crude A.sinensis from M inxian；F.processed A.sinensis from M inxian；1～8.common peaks；1.ferulic acid

由圖3可以看出，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸的HPLC特征圖譜中各成分的種類差別不大，采用特征圖譜技術(shù)可以有效鑒別甘肅當(dāng)歸藥材。但甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸炮制前后的HPLC特征圖譜中某些成分的含量發(fā)生了明顯變化，如炮制后2、3、4號峰含量明顯降低，1、6號峰含量略有降低，說明炮制對當(dāng)歸成分含量具有一定的影響。

2.6 甘肅當(dāng)歸炮制前后阿魏酸的含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密量取適量的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于容量瓶中，用甲醇配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為1.000、0.100、0.050、0.020、0.010、0.001mg·m L-1，按“2.2”項下色譜條件分別進(jìn)樣10μL測定。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝18 361 200.531X+23 738.962（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，阿魏酸的質(zhì)量濃度在0.001～1.000mg·m L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗 取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μL，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果，RSD＝0.57%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取甘肅渭源當(dāng)歸供試品溶液適量，分別于配制后0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.13%（n＝6），表明供試品溶液中阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗 取甘肅渭源當(dāng)歸樣品適量，按“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，RSD＝2.70%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的甘肅渭源當(dāng)歸樣品粉末6份，每份0.5 g，分別精密加入相當(dāng)于含阿魏酸0.4 mg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.6.6 炮制前后阿魏酸含量測定 分別精密稱取甘肅漳縣當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸、甘肅渭源當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸、甘肅岷縣當(dāng)歸片與酒當(dāng)歸樣品適量，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件分析。各供試品溶液分別進(jìn)樣測定3次，以峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各樣品中阿魏酸的含量，并計算平均值，結(jié)果見表2。

表2 甘肅當(dāng)歸炮制前后阿魏酸的含量Tab 2 Contents of ferulic acid in crude and processed Gansu A.sinensis

由表2可見，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中阿魏酸的含量有較大差異，但成分種類和成分間的比例關(guān)系基本相似，原因可能為阿魏酸含量受當(dāng)歸的品種、產(chǎn)地和采收期影響較大。此外，研究還發(fā)現(xiàn)甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸炮制后阿魏酸含量略有降低。由此可見，在整體特征圖譜相似性良好的情況下，飲片所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異。因此，有必要在特征圖譜評價的基礎(chǔ)上增加指標(biāo)性成分的含量測定，從而全面評價中藥飲片的質(zhì)量。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

本研究對樣品的提取方法進(jìn)行了考察，以共有峰的峰面積作為評價指標(biāo)，分別采用加熱回流提取和超聲提取來制備甘肅渭源當(dāng)歸供試品溶液，提取次數(shù)分別考察了1、2、3次，將各樣品按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行液相分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同提取方法、不同提取次數(shù)，對8個共有成分的提取率各不相同?？紤]到盡量多的提取成分和操作簡單、快速等因素，采用甲醇超聲提取2次，每次30m in作為樣品提取工藝。

3.2 樣品提取溶劑的選擇

本研究分別采用20%、40%、60%、80%和100%甲醇提取甘肅渭源當(dāng)歸樣品，制備不同提取溶劑的供試品溶液，將各樣品按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行液相分析，以8個共有峰的峰面積為評價指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同提取溶劑對8個共有成分的提取率各不相同?？紤]到盡量多的提取成分，采用100%甲醇作為提取溶劑。

3.3 測定波長的選擇

本研究比較了210、230、254、260、280、365 nm等波長下供試品溶液的出峰情況，發(fā)現(xiàn)其在254 nm波長處各峰分離好，整體峰形優(yōu)于其他波長，峰形也好，溶劑干擾少，基線平穩(wěn)，故選用254 nm作為特征圖譜測定波長。

3.4 流動相的選擇

本研究比較了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液等溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果以乙腈-乙酸水溶液系統(tǒng)所得圖譜的峰形較好、分離度高，所以選用乙腈-0.2%乙酸水溶液作為本試驗的流動相系統(tǒng)。

3.5 柱溫和流速的選擇

本研究比較了不同柱溫（25、35、45℃）及不同流速（0.8、1、1.2m L·m in-1）條件下樣品的HPLC特征圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫35℃、流速1m L·m in-1時，樣品分離度較好、峰形對稱，能夠滿足分析要求。

3.6 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，特征圖譜技術(shù)可以有效進(jìn)行中藥飲片的鑒別，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸飲片的HPLC特征圖譜差異不大，但是在整體圖譜相似性良好的情況下，藥材所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異，如當(dāng)歸中的主要成分阿魏酸在不同樣品中含量各不相同[6，7]。因此，有必要在特征圖譜評價基礎(chǔ)上增加有效成分的含量測定，從而全面評價中藥飲片的質(zhì)量，建立更加全面、科學(xué)、合理的中藥飲片質(zhì)量評價體系。

[1]黃偉暉，宋純清.當(dāng)歸的化學(xué)和藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2001，26（3）：147.

[2]李 琰，徐麗珍，林 佳，等.不同產(chǎn)地當(dāng)歸中阿魏酸的含量比較[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（11）：838.

[3]歐陽曉玫，何英梅，朱俊儒，等.甘肅不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量考察[J].中國藥師，2007，10（3）：206.

[4]宋金春，胡傳芹，劉 紅，等.炮制對當(dāng)歸藥材有效成分的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（14）：1 052.

[5]吳 華，李景清，安文源，等.香青蘭藥材HPLC特征圖譜的研究[J].藥物分析雜志，2009，29（7）：1 178.

[6]歐陽曉玫，何英梅，朱俊儒，等.甘肅產(chǎn)當(dāng)歸的商品規(guī)格與其阿魏酸含量的相關(guān)性初探[J].中國藥事，2005，19（7）：423.

[7]王 芳，李 東.當(dāng)歸的化學(xué)及藥理研究進(jìn)展[J].中國藥房，2003，14（10）：630.