余甘子提取物對尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用研究Δ

岑志芳，張繼平，李海燕，曾煦欣，吳劍峰#（.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山市58000；.廣東佛山市第二人民醫(yī)院，佛山市 58000）

痛風(fēng)是因長期嘌呤代謝障礙，高尿酸血癥引起組織損傷的一組臨床綜合征。臨床上可見高尿酸血癥、特征性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石形成，嚴(yán)重者可致腎尿酸結(jié)石和痛風(fēng)性腎實質(zhì)病變和其他并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人體健康。余甘子又名山油柑、油甘子、余甘果等，為大戟科葉下珠屬植物余甘子（Phylllanthusemblica）的成熟果實[1]。民間一直有服用該藥治療痛風(fēng)的習(xí)慣，并且與其他藥材一起配制成復(fù)方使用，如藏藥十五味乳鵬丸，對于關(guān)節(jié)紅腫疼痛、發(fā)癢、痛風(fēng)、黃水積聚就有良好療效[2]。本文研究余甘子不同部位提取物對大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的防治作用及作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PV-200型足趾容積測量儀（成都泰盟科技有限公司）；水浴箱（浙江金壇市白塔金昌實驗儀器廠）；UV-2450/2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；TGL-16G-A型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SN-695B型放免γ測量儀（上海原子核所日環(huán)儀器廠）。

1.2 試藥

余甘子藥材（采自廣東汕頭）經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院李海燕副教授鑒定為真品；秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限公司，批號：101028）；尿酸鈉（美國Sigma公司）；甲醇（江蘇強盛化工有限公司，批號：20080729）；氫氧化鈉（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號：20040803）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠80只，♂，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（粵）2008-0020）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 余甘子提取物的制備 取余甘子生藥材適量，置于錐形瓶中，加入甲醇。加熱連續(xù)回流4次，每次1.5 h，趁熱過濾。將4次所得濾液減壓蒸餾，回收甲醇，得到余甘子醇提濃縮液，呈浸膏狀。取醇提物500 g，加適量蒸餾水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別提取出3個極性部位，最后的部分靜置使其分出水相部分。得到各部分提取液后減壓蒸餾，得到各部分濃縮液用于實驗，余甘子醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物得率分別為0.85%、7.8%、13.35%、38.60%。

2.1.2 尿酸鈉晶體溶液的制備 用194m L蒸餾水加6m L的1mol·L-1NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1mol·L-1HCl調(diào)pH值為7.2，攪拌冷卻，4℃貯藏24 h，去上清液，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末[3]，放入研缽內(nèi)研成細末，用孔徑250μm的金屬網(wǎng)篩過篩，制成尿酸鈉結(jié)晶。取尿酸鈉結(jié)晶加生理鹽水，再加1m L吐溫80，加熱攪拌，得25mg·m L-1尿酸鈉溶液。

2.2 模型的復(fù)制、分組與給藥

實驗分為8組，即空白對照、模型、秋水仙堿（0.8mg·kg-1）、石油醚部位（5 g·kg-1）、乙酸乙酯部位（5 g·kg-1）、正丁醇部位（5 g·kg-1）、水相部位（5 g·kg-1）、醇提物（5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥前，將大鼠的左后肢浸入足趾容積測定儀內(nèi)，讀取大鼠左后肢的正常足趾容積，連續(xù)3次，求其平均值作為正常值（此為0 h的足腫脹值）。末次給藥1 h后，無菌操作，每只鼠左后足趾sc 0.2m L尿酸鈉晶體溶液復(fù)制模型，分別于注射后1、2、4、6、8、12、24、48 h測定大鼠足趾容積。

2.3 余甘子提取物對大鼠24 h步態(tài)行為的影響

分別于復(fù)制模型24 h后觀察各組大鼠的步態(tài)并進行評分分級，根據(jù)文獻[4]標(biāo)準(zhǔn)進行評分：0分為正常步態(tài)，雙足均勻著地；1分為輕度跛行，受試下肢略有彎曲；2分為中度跛行，受試下肢剛觸及地面；3分為重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走。

2.4余甘子提取物對大鼠關(guān)節(jié)組織前列腺素E2（PGE2）含量的影響

各組大鼠測完最后時間點（復(fù)制模型后48 h）踝關(guān)節(jié)腫脹后，處死大鼠，距右踝關(guān)節(jié)上0.5 cm處剪下右足，稱重，剝皮后浸泡于5m L生理鹽水中1 h，以1 500 r·m in-1離心10m in，吸取上清液0.5m L，加入0.5mol·L-1氫氧化鈉-甲醇溶液 2m L，于50℃水浴箱中水浴異構(gòu)化20m in，加甲醇稀釋至20m L后，參照文獻[5]方法于紫外分光光度計278 nm波長處測定吸光度（OD），以每1 g炎性組織相當(dāng)?shù)腛D值顯示PGE2的含量。

2.5 余甘子提取物對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的影響

各組大鼠測完最后時間點（復(fù)制模型后48 h）踝關(guān)節(jié)腫脹后，乙醚麻醉取血，全血以3 000 r·min-1離心10min，取上清液，－20℃貯藏，放射免疫法測定TNF-α含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

與空白對照組同一時間點比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著增加（P＜0.01），復(fù)制模型約0.5 h后開始腫脹，隨后顯著增加，大概在4 h時達到最高峰，提示復(fù)制模型成功。與模型組比較，余甘子醇提物組8、12、24 h時，余甘子乙酸乙酯部位組6、8、24、48 h時，余甘子正丁醇部位組在8、12、24、48 h時，余甘子水相部位組8、12、24 h時，余甘子石油醚部位組在24 h時顯著降低（P＜0.05）。提示余甘子對模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹有顯著的抑制作用，尤其是醇提物、正丁醇部位、水相部位和乙酸乙酯部位作用較為明顯。余甘子提取物對模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響見圖1。

3.2 對模型大鼠24 h步態(tài)行為的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠活動減少，右后肢彎曲，行走時出現(xiàn)不同程度的跛行，大鼠24 h步態(tài)評分顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，余甘子醇提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位、水相部位組大鼠步態(tài)明顯得到改善，評分顯著降低（P＜0.05）。余甘子提取物對模型大鼠24 h步態(tài)行為的影響見表1。

3.3 對模型大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2含量顯著提高（P＜0.01），提示關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)劇烈。與模型組比較，余甘子的醇提物、正丁醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位組大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。余甘子提取物對模型大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2含量的影響見表2。

3.4 對模型大鼠血清TNF-α含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α的含量顯著提高（P＜0.01）。與模型組比較，正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位組大鼠血清TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），說明余甘子可能通過抑制血清炎性介質(zhì)釋放從而減輕炎癥反應(yīng)。余甘子提取物對模型大鼠血清TNF-α含量的影響見表3。

表1 余甘子提取物對模型大鼠24 h步態(tài)行為的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of the extracts of P.emblica on 24 h gait behavior inmodel rat（s±s，n＝10）

表1 余甘子提取物對模型大鼠24 h步態(tài)行為的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of the extracts of P.emblica on 24 h gait behavior inmodel rat（s±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05 vs.blank controlgroup：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

1分劑量2分3分組別24h步態(tài)評分0分空白對照組模型組＊秋水仙堿組#余甘子醇提物組#余甘子石油醚部位組#余甘子乙酸乙酯部位組#余甘子正丁醇部位組#余甘子水相部位組#－ -10 0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 1 1 3 1 0 3 5 5 6 8 6 7 0 7 1 2 3 1 1 2

表2 余甘子提取物對模型大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of the extracts of P.emblica on PGE2 level of joint tissue inmodel rat（s±s，n＝10）

表2 余甘子提取物對模型大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of the extracts of P.emblica on PGE2 level of joint tissue inmodel rat（s±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組秋水仙堿組余甘子醇提物組余甘子石油醚部位組余甘子乙酸乙酯部位組余甘子正丁醇部位組余甘子水相部位組PGE2/mg·kg-1 6.65±3.02 46.91±20.31＊31.74±9.98#19.07±6.01##30.18±17.26#31.38±13.75#20.04±4.51##38.67±22.78劑量--0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1

表3 余甘子提取物對模型大鼠血清TNF-α含量的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of the extracts of P.emblica on serum TNF-α level inmodel rat（s±s，n＝10）

表3 余甘子提取物對模型大鼠血清TNF-α含量的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of the extracts of P.emblica on serum TNF-α level inmodel rat（s±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank controlgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.05

組別空白對照組模型組秋水仙堿組余甘子醇提物組余甘子石油醚部位組余甘子乙酸乙酯部位組余甘子正丁醇部位組余甘子水相部位組0.330±0.099 0.489±0.111＊0.370±0.086#0.430±0.101 0.356±0.059#0.374±0.095#0.336±0.103#0.393±0.131--0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 TNF-α/ng·mL-1劑量

4 討論

現(xiàn)代藥理研究證明，余甘子乙醇和水提取物對醋酸所致的小鼠扭體反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；余甘子粉能顯著抑制大鼠瓊脂性足跖腫脹和二甲苯所致小鼠耳殼腫脹，顯著抑制組胺所致的毛細管通透性增強和白細胞游出[5，6]。也有文獻顯示，余甘子醇提物乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌有強抑制作用[7]。本研究顯示，余甘子提取物能顯著改善模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度、步態(tài)指數(shù)等關(guān)節(jié)炎的癥狀與指標(biāo)，同時能顯著降低模型大鼠關(guān)節(jié)組織PGE2與血清TNF-α水平，與上述文獻結(jié)果相吻合。說明余甘子具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，其機制是抑制局部組織和血清炎癥介質(zhì)PGE2和TNF-α的釋放。對石油醚、正丁醇、乙酸乙酯等5個提取部位的藥效結(jié)果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)正丁醇與乙酸乙酯對上述指標(biāo)均有明顯作用，醇提部位雖然對足腫脹、步態(tài)指數(shù)、組織PGE2有明顯作用，但對血清TNF-α無影響，而且對足腫脹的有效時間只能持續(xù)到24 h，不如正丁醇部位與乙酸乙酯部位。本研究對象為大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，綜合上述指標(biāo)判斷，余甘子抗痛風(fēng)作用的有效部位主要在正丁醇和乙酸乙酯部位，本研究可為進一步探討余甘子抗痛風(fēng)作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

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