RP-HPLC 法測(cè)定小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量

黃麗玫，謝植基，毋福海（廣東藥學(xué)院，廣州市 510310）

小兒清肺化痰口服液是由麻黃、黃芩、葶藶子、前胡、炒紫蘇子等8味藥材經(jīng)提取制成的中藥成方制劑，具有清熱化痰、止咳平喘之功效。臨床用于小兒風(fēng)熱犯肺所致的咳嗽，癥見呼吸急促、咳嗽痰喘、喉中作響等。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芩苷的含量[1]。已有HPLC法測(cè)定黃芩苷含量的報(bào)道[2]，但槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量測(cè)定還未見文獻(xiàn)報(bào)道。葶藶子為方中主藥，系常用中藥，具有止咳平喘、消腫利尿及強(qiáng)心之功效。藥理研究表明，葶藶子具有強(qiáng)心、止咳、平喘、抗菌、降血脂、抗癌等多方面作用[3]。葶藶子來(lái)源于十字花科植物獨(dú)行菜Lep id ium apetalumWilld.或播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，后者習(xí)稱南葶藶子。南葶藶子的化學(xué)成分研究近年受到關(guān)注[3～6]，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷是近年來(lái)從南葶藶子中分離得到的化合物，僅存在于南葶藶子中[5]，為2010年版《中國(guó)藥典》含量測(cè)定指標(biāo)成分[7]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，筆者建立了小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測(cè)定的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，該法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀（美國(guó)安捷倫公司），包括Agilent 1100系列雙元泵、Agilent 1100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、Agilent 1100/化學(xué)工作站；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W）。

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111854-201001）；小兒清肺化痰口服液（北京長(zhǎng)城制藥廠，批號(hào)：10050102、09040301、10070601，規(guī)格：每支10 mL）；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為100 μg·mL－1）。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取小兒清肺化痰口服液10 mL，置于蒸發(fā)皿中，于水浴上加熱揮干，加入30%甲醇溶解，移至25 mL容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，超聲處理15 min，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方組成中除葶藶子外的其余成分制成不含葶藶子的陰性對(duì)照，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法處理，即得陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（9∶91）；流速：0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25℃。分別取對(duì)照品溶液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為30 μg·mL－1）、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10μL注入HPLC儀，理論板數(shù)以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 500；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的拖尾因子為0.96，保留時(shí)間約為26.8 min，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰與其他組分峰的分離度＞1.5；陰性樣品不干擾測(cè)定，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品貯備液，加30%甲醇稀釋成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為5、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1的溶液。依次進(jìn)樣10μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品溶液系列濃度（C）進(jìn)行回歸，得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷回歸方程A＝14.24C－5.12，r＝0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷檢測(cè)濃度在5～60μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取濃度為30μg·mL－1的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果，其峰面積的平均值為424.3，RSD＝0.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：10050102）在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰面積的平均值為389.3，RSD＝0.83%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：10050102））樣品適量，共6份，按“2.1.2”方法提取，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量為69.0 μg·mL－1，RSD＝0.65%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：10050102）適量，共6份，加入相應(yīng)量的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品，照“2.1.2”方法處理，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均加樣回收率為104.2%，RSD＝0.50%，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取小兒清肺化痰口服液樣品適量，共3批，照“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液（30 μg·mL－1）與供試品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n≥3）Tab 2Results of sample determination（n≥3）

3 討論

南葶藶子藥材有效部位中，含有以槲皮素、山柰酚、異鼠李素為苷元的多種系列黃酮類化合物，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量最多，特征性較強(qiáng)，且具有較好的專屬性和平喘有效性，因此含量測(cè)定選擇以其為指標(biāo)成分。

筆者在試驗(yàn)過(guò)程中考察了不同提取溶劑（30%甲醇、甲醇、甲醇-鹽酸）的提取效率，發(fā)現(xiàn)以30%甲醇為溶劑提取較完全；對(duì)溶劑用量、提取方式（回流、超聲）、提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化后，確定了文中供試品的制備方法。

參照文獻(xiàn)方法[8]以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，峰形較差，分離度無(wú)法滿足要求。改用乙腈-0.1%醋酸（11∶89）為流動(dòng)相[7，9]，出峰太快，經(jīng)比較后以乙腈-0.1%醋酸（9∶91）為流動(dòng)相峰形較好，分離度符合要求。

檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[7，9]測(cè)定時(shí)，小兒清肺化痰口服液樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近有干擾，參照文獻(xiàn)[8]，選定260 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，靈敏度高，且槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近無(wú)干擾。

綜上所述，本試驗(yàn)采用RP-HPLC法測(cè)定小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量，方法學(xué)驗(yàn)證表明，其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收試驗(yàn)和重復(fù)性均能滿足定量的要求，可用于小兒清肺化痰口服液的質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：495.

[2] 李美月，施夏蓉，唐元軍.HPLC法測(cè)定小兒清肺化痰口服液中黃芩苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2008，20（6）：61.

[3] 孫 凱，李 銑.葶藶子化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2002，33（7）：附3.

[4] 王愛芹，王秀坤，趙海譽(yù)，等.南葶藶子化學(xué)成分與質(zhì)量研究[J].中國(guó)藥物與臨床，2005，5（1）：5.

[5] 王愛芹，王秀坤，李軍林，等.南葶藶子的化學(xué)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（1）：46.

[6] 孫 凱，李 銑.南葶藶子的化學(xué)成分[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（6）：419.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：313.

[8] 王愛芹，王秀坤，閆興麗，等.HPLC測(cè)定南葶藶子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2004，29（10）：959.

[9] 李進(jìn)冉，黃文華，郭寶林，等.南葶藶子藥材含量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].藥物分析雜志，2010，30（5）：950.