黃芩多糖體外抗新城疫病毒活性試驗(yàn)

王鑫瀅，張秀英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩（Scuxiutellaria baicalensis Georgi）的粗提物及其活性部位、單體具有多種藥理活性［1-2］，但對新城疫病毒（NDV）的作用目前未見報(bào)道。NDV可引發(fā)雞和火雞的急性、熱性、敗血性疫病，具有高度的接觸傳染性，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展［3-4］，目前獸醫(yī)臨床缺乏有效的防治藥物。因此，研究開發(fā)出耐藥性低、副作用和不良反應(yīng)少的有效藥物對新城疫的預(yù)防及治療都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本文通過對黃芩多糖的體外抗NDV的作用進(jìn)行試驗(yàn)，為抗NDV的新型藥物的研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雞胚 新城疫病毒F48E9強(qiáng)毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；HA為1∶26。

1.2 藥品與試劑 黃芩（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)），胰酶，優(yōu)級胎牛血清，DMEM，四甲基氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO），均來自Sigma公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（Thermo，德國），倒置顯微鏡（Nikon，日本），恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），索氏提取器。

1.4 雞成纖維細(xì)胞制備［3］取10日齡雞胚，經(jīng)取材、清洗、剪碎、再清洗、消化、吹打、過濾，在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，制成雞成纖維細(xì)胞。

1.5 黃芩多糖的提取、分離、純化［4］利用水提醇沉法提取黃芩多糖，Sevage法（氯仿∶正丁醇=5∶1），除去蛋白，透析除去無機(jī)物和大分子物質(zhì)，真空干燥，即得黃芩多糖。

1.6 黃芩多糖對細(xì)胞安全濃度（TC0）的測定 在CEF中分別加入不同濃度的黃芩多糖，37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況，根據(jù)細(xì)胞病變程度（CPE）再結(jié)合 MTT法確定多糖對細(xì)胞的TC0。CPE的記錄方法：“-”為沒有細(xì)胞出現(xiàn)CPE；“+”為1%～25%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE；“++”為26%～50%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE；“+++”為51%～75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，“++++”為76%～100%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE。

1.7 黃芩多糖抗NDV的活性試驗(yàn) 在黃芩多糖安全濃度的基礎(chǔ)上，將其進(jìn)行倍比稀釋，濃度分別為1∶2～1∶64，0.22μm濾菌膜過濾除菌后，進(jìn)行以下操作：（1）先加多糖后接種病毒：將各濃度的多糖加入到CEF中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后取出，加入用維持液稀釋成100TCID50的病毒液，100μL／孔。（2）先接種病毒后加多糖：將100TCID50的病毒液，100 μL／孔，加入到CEF中，繼續(xù)培養(yǎng)2h后取出，然后加入各種濃度的多糖。（3）病毒和多糖同時加入：先將100TCID50的病毒液，100μL／孔，加入到 CEF中，緊接著加入各種濃度的多糖。

以上3組試驗(yàn)，加入各個濃度多糖和病毒液（多糖+病毒組）的為試驗(yàn)組；只加多糖不加病毒液的為多糖對照組；同時設(shè)病毒唑陽性藥物對照組，加病毒唑（用維持液稀釋終濃度為4000μg／mL，由預(yù)試驗(yàn)而定）；病毒對照組，加病毒液；細(xì)胞對照組，加維持液。100μL／孔，每種濃度重復(fù)4孔，另設(shè)一無細(xì)胞孔僅加維持液作為測定時調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)，每組以加入病毒液后計(jì)算時間，每隔12h觀察一次CPE變化，直至病毒對照組出現(xiàn)典型的CPE（++++）病變后為記錄終點(diǎn)，MTT法檢測細(xì)胞OD值。

多糖抗病毒活性的評價標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)OD值統(tǒng)計(jì)，比較多糖+病毒組、病毒唑?qū)φ战M與病毒對照組；多糖組與細(xì)胞對照組；多糖+病毒組與同濃度多糖組之間的OD值，判定多糖的抗病毒活性強(qiáng)弱。在多糖對細(xì)胞增殖無顯著影響或顯著抑制細(xì)胞增殖前提下，若多糖+病毒組OD值顯著大于病毒對照組，且與同濃度中藥組差異不顯著，判為多糖具有顯著的抗病毒活性；若多糖+病毒組顯著大于病毒對照組且顯著小于同濃度多糖組，或與病毒對照組及同濃度中藥組差異均不顯著，判為多糖具有一定抗病毒活性；若多糖+病毒組與病毒對照差異不顯著，且顯著小于同濃度多糖組，判為多糖無抗病毒活性［6］。計(jì)算藥物的治療指數(shù)（TI）=最大無毒濃度／最小有效濃度。TI值越高，多糖的安全性越高。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩多糖對細(xì)胞最大安全濃度的測定 見表1。

表1 加入各濃度黃芩多糖后各組細(xì)胞的細(xì)胞存活率

由表1的OD值變化可知，隨著多糖濃度逐漸降低，細(xì)胞存活率逐漸升高，濃度在125.00μg／mL時細(xì)胞存活率達(dá)到97%，可初步認(rèn)為對CEF的生長基本無影響，綜合CPE和MTT結(jié)果可確定黃芩多糖對細(xì)胞的最大安全濃度為TC0=125.00μg／mL。

2.2 黃芩多糖抗病毒活性檢測結(jié)果 見表2、3、4。

表2 先加藥物后加病毒組的OD值變化

根據(jù)多糖抗病毒活性的評價標(biāo)準(zhǔn)：通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析可知多糖濃度為125μg／mL和62.5μg／mL時，具有顯著的抗病毒活性；多糖濃度為31.25μg／mL及15.63μg／mL時，可以判定其具有一定的抗病毒活性；多糖濃度為7.81μg／mL時，可以判定為無抗病毒活性。黃芩多糖的TI=125／15.63=8。

表3 先加病毒后加藥物組的OD值變化

根據(jù)多糖抗病毒活性的評價標(biāo)準(zhǔn)：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知多糖濃度為125μg／mL和62.5μg／mL時，可以判定具有一定的抗病毒活性；其余各濃度的多糖，可以判定為無抗病毒活性。黃芩多糖的TI=125／62.5=2，這表明黃芩多糖直接殺滅NDV的作用較弱。

表4 藥物與病毒同時加入組的OD值變化

3 討論

通過NDV對雞胚成纖維細(xì)胞的強(qiáng)力致病變作用特性，在此基礎(chǔ)上對黃芩多糖抗NDV的活性進(jìn)行了系統(tǒng)的試驗(yàn)。結(jié)果表明，黃芩多糖對NDV具有較好的預(yù)防及治療作用，兩種作用的治療指數(shù)均達(dá)到8，同時表明黃芩多糖的藥物安全性很高；但是黃芩多糖對病毒的直接滅活作用相對較低，治療指數(shù)僅為2，可能是由于多糖對細(xì)胞的吸附能力較病毒弱，發(fā)揮實(shí)效較短。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，如果進(jìn)一步加深對黃芩多糖的研究與開發(fā)，有望研發(fā)出安全性高，毒副作用小，效果可靠的新型抗新城疫藥物。

［1］賀海平.黃芩藥理研究的新進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)：中醫(yī)中藥分冊，2000，22（1）：14-16.

［2］劉樺，吳曉冬，閆倩，等.黃苓苷對缺氧缺糖性心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（1）：55-57.

［3］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［4］劉云.當(dāng)歸多糖的提取及含量測定［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17（1）：49-50.

［5］司徒正強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安：世界圖書館出版公司，2004.

［6］胡元亮，孔祥鋒，李祥瑞，等.10種中藥成分對CEF的增值和抵抗 NDV感染的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：301-305.