不同程度乳腺炎血清中相關(guān)細(xì)胞因子的試驗

李曉蕾，張 宇，劉本軍，高 利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

奶牛乳腺炎作為危害養(yǎng)牛業(yè)的一大疾病，臨床診斷和防治一直是研究的重點，特別是臨床診斷方面的研究一直是研究的熱點。有關(guān)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等因子與炎癥的關(guān)系目前比較明朗，但他們的變化及變化趨勢與不同程度乳腺炎的發(fā)展趨勢是否存在相關(guān)性還不確定，基于此，本試驗通過體細(xì)胞分類確定不同程度乳腺炎，同時測定這些病例血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的變化，探討奶牛乳腺炎的發(fā)病程度及變化是否與上述4種細(xì)胞因子含量及變化存在一定關(guān)系，為今后診斷奶牛乳腺炎提供一種參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 IL-1β放免試劑盒，IL-6放免試劑盒，IL-8放免試劑盒，TNF-α放免試劑盒，體細(xì)胞計數(shù)儀，電冰箱，高速離心機(jī)，全自動γ免疫計數(shù)器。

1.2 試驗動物及分組 阿城區(qū)某奶牛場，本試驗選取年齡在4～8歲，2～5胎的經(jīng)產(chǎn)奶牛，要求奶牛處于泌乳盛期或中期，即產(chǎn)后2～7個月。通過現(xiàn)場臨床檢查和CMT的檢測及體細(xì)胞計數(shù)儀的檢測進(jìn)行分組。其中10頭檢測為陰性的奶牛編為C組，乳汁體細(xì)胞檢查在0～50萬個／mL；10頭檢測為輕度隱性乳腺炎奶牛編為Ⅰ組，乳汁體細(xì)胞檢查在50萬～150萬個／mL；10頭檢測為重度隱性乳腺炎奶牛編為Ⅱ組，乳汁體細(xì)胞檢查在150萬～500萬個／mL；10頭檢測為臨床型乳腺炎的奶牛編為 Ⅲ 組，乳汁體細(xì)胞檢查在500萬個／mL以上。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集、血清制備 頸靜脈采集血樣C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的血液，采樣前消毒取血部位，對每頭牛約取15mL的血液。自然凝固1～2h，冰浴30min，然后3000r／min離心10 min，分離血清，4℃保存，待測。

1.3.2 結(jié)果判斷 放射免疫分析法。結(jié)果計算：以N／T、B／T計算NSB、S0結(jié)合百分率，以B／B0計算標(biāo)準(zhǔn)及待測物結(jié)合百分率，在半對數(shù)座標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值或由自動γ-計數(shù)儀器直接讀結(jié)果。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 SPSS數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量的測定見表1。

表1 血清各組中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量SD）

表1 血清各組中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量SD）

＊：顯著性差異，P＜0.05；＊＊：極顯著性差異，P＜0.01

由表1和圖1～4可以看出：（1）與C組比較，Ⅰ組IL-1β的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-1β的含量極顯著升高（P＜0.01）。（2）與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）。（3）與C組比較，Ⅰ組IL-8的含量顯著升高（P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-8的含量極顯著升高（P＜0.01）。（4）與C組比較，Ⅰ組TNF-α的含量顯著升高（P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組 TNF-α的含量均極顯著升高（P＜0.01）。由此可知，奶牛乳腺發(fā)生炎癥后血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量均高于正常奶牛，且含量隨炎癥程度的加劇逐漸升高；而血清中IL-1β的含量也隨炎癥程度的加劇逐漸升高，但到臨床癥狀明顯時含量又有所下降。

3 討論

IL-1β是炎癥反應(yīng)早期最具影響的介質(zhì)之一。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺炎癥狀后，IL-1β的產(chǎn)生和釋放逐漸增加，當(dāng)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時含量有所減少，但仍然高于對照組。主要原因可能是因為IL-1β是急性期反應(yīng)的主要誘導(dǎo)物，待炎癥發(fā)生后在體內(nèi)的含量也逐漸降低。

IL-6是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成成分，與體內(nèi)感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)（Headley A S，et al.，1997）。有研究表明，奶牛乳腺炎的發(fā)生和臨床癥狀與細(xì)胞因子有關(guān)，乳腺炎急性期反應(yīng)就是由IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子激發(fā)和介導(dǎo)（Taylor B C，et al.，1997；Zhu Y，et al.，2007）。IL-6是一種遲發(fā)性細(xì)胞因子，能催化和放大炎性反應(yīng)，隨著炎癥的加劇體內(nèi)IL-6含量也增加，與此同時，炎癥激活機(jī)體免疫功能，血液中的淋巴細(xì)胞被活化后IL-6等炎性反應(yīng)因子分泌合成功能增強(qiáng)，于是血液中IL-6含量也增加（吳朝棟，1995）。

IL-8是PMN、嗜堿性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞等細(xì)胞的趨化因子，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用（Matsushima K，1994）。本試驗表明，IL-8隨炎癥的加劇含量也逐漸增加，這主要是因為當(dāng)乳腺發(fā)生炎癥時，血清中內(nèi)毒素水平增高而刺激炎性細(xì)胞釋放IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子，在這些細(xì)胞因子的刺激誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞和PMN等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-8，這一結(jié)果表明，血清中的IL-8有助于機(jī)體炎癥的發(fā)展。TNF-α參與炎癥反應(yīng)并且加劇炎癥的發(fā)生。本試驗表明，TNF-α可大量分泌，與之前（Spicer L J 2001）報道的當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺炎時，IL-6、TNF-α的釋放增加，其含量與臨床癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)的報道一致。TNF-α可能是導(dǎo)致乳腺炎病情加重的原因。血清中TNF-α水平可作為今后檢測乳腺炎病程嚴(yán)重程度的一項重要指標(biāo)。

以上試驗結(jié)果表明，這4種細(xì)胞因子除IL-1β以外，其他細(xì)胞因子在血清中的含量均隨著炎癥的加劇逐漸增加。而血清中IL-1β的含量也隨著炎癥的加劇逐漸增加，當(dāng)出現(xiàn)明顯的乳腺炎癥狀時，含量又有所減少，但仍然顯著高于對照組。由此可知，奶牛血清中的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量與奶牛乳腺是否發(fā)生炎癥反應(yīng)以及奶牛機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)（Dernfalk J，et al.，2007）。

4 結(jié)語

奶牛乳腺發(fā)生炎癥后血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量與正常奶牛比較隨炎癥程度的加劇逐漸升高；但I(xiàn)L-1β的含量隨炎癥程度的加劇表現(xiàn)先升高后降低。表明，奶牛血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量與奶牛乳腺炎的發(fā)病程度密切相關(guān)。

［1］吳朝棟.內(nèi)毒素誘生的細(xì)胞因子及其作用研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，1995，3（1）：11-14.

［2］Dernfalk J，Persson Waller K.The xMAP technique can be used for detection of the inflammatory cytokines IL-1beta，IL-6and TNF-alpha in bovine samples［J］.Vet Immunol Immunopathol，2007，118（1-2）：40-49.

［3］Headley A S，Tolly E，Meduri G E，et al.Infection and the inflammatory respond in acute respiratory distress syndromc［J］.Chest，1997，111：1306-1312.

［4］Matsushima K.Properties of interleukin-8and its correlation with inflammatory diseases and malignant neoplasia［J］.Gan To Kagaku Ryoho，1994，21：2525-2532.

［5］Spicer L J.Receptors for insulin-like growth factor-I and tumor necrosis factor-alpha are hormonally regulated in bovine granulosa and thecal cells［J］.Anim Reprod Sci，2001，67：45-58.

［6］Taylor B C，Keefe R G，Dellinger J D，et al.T cell Population and cytokine expression in milk derived from normal and bacteria-infected bovine mammary glands.Cellular Immunology［J］.1997，182（2）：68-76.

［7］Zhu Y，F(xiàn)ossum C，Berg M，et al.Morphometric analysis of proinflammatory cytokines in mammary glands of sows suggests an association between clinical mastitis and local production of IL-1beta，IL-6and TNF-alpha［J］.Vet Res，2007，38（6）：871-882.