黑龍江省部分地區(qū)鵝致病性大腸桿菌血清型鑒定及藥敏試驗

趙 陽，王藝萌，張文龍，馬 波，王君偉

（東北農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國是世界上養(yǎng)鵝數(shù)量和鵝食品消費量最多的國家。隨著集約化養(yǎng)殖的普及，鵝致病性大腸桿菌對養(yǎng)鵝業(yè)的危害和導致的經濟損失日益嚴重，成為目前危害養(yǎng)鵝業(yè)傳染病之一。

鵝大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏桿菌所引起的一種傳染病，不同品種和日齡的鵝均可發(fā)病，但仔鵝最易感。在臨床上主要表現(xiàn)為敗血癥、纖維素性氣囊炎、肝周炎、心包炎和腹膜炎。近年來，隨著抗菌藥物的大量應用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，鵝大腸桿菌病的發(fā)生有逐年上升的趨勢，部分地區(qū)鵝大腸桿菌病的流行情況已比較嚴重。

本試驗從黑龍江省部分地區(qū)中分離了鵝致病性大腸桿菌，并對鑒定出的大腸桿菌進行血清型分析和藥敏試驗，為了解鵝大腸桿菌病在本省的流行情況，指導用戶選擇合適的治療藥物以及制定科學的防治措施提供部分參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術責任有限公司。微量發(fā)酵管，藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，大腸桿菌抗O1～O163因子血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察 將病料無菌劃線接種于麥康凱平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取麥康凱平板上的紅色單菌落進行革蘭染色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 生化試驗 挑取革蘭陰性短桿菌的單菌落在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)后，按說明書接種微量生化管。

1.2.3 血清型測定 取大腸桿菌試管斜面培養(yǎng)物劃線接種麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。挑取平板上光滑、圓整的單個紅色菌落，接種普通瓊脂斜面和液體肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)期間肉湯振蕩數(shù)次。用0.5%石炭酸生理鹽水1.5mL洗下普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，置小試管中，與肉湯小瓶培養(yǎng)物一起于121℃高壓2h。取小試管的高壓抗原分別與大腸桿菌多價血清、單因子血清進行平板凝集反應。小試管用于平板凝集，肉湯小瓶抗原用于試管凝集。

血清型鑒定按中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的產品使用說明書進行操作。所有分離株首先經平板凝集試驗初步篩選出可能的O血清型，然后通過試管凝集試驗確定其O血清型。定型標準為血清的試管凝集價不小于1∶640。每次試驗同時以高壓抗原與0.5%苯酚生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。3min內出現(xiàn)凝集者為陽性反應。

1.2.4 藥敏試驗 將分離到的61株大腸桿菌在無菌條件下分別接種肉湯培養(yǎng)基，然后放入搖床中培養(yǎng)6h后計數(shù)，調節(jié)菌液的含菌量為108個／mL。按常規(guī)紙片法進行藥敏試驗。

2 結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng) 經37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，在麥康凱瓊脂平板上形成紅色的大小中等菌落。挑取單個紅色單菌落劃線接種于在普通瓊脂平板上純培養(yǎng)后，形成表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起，中等大小的菌落。在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上呈黑紅色并有金屬光澤。革蘭染色鏡檢可見兩端純圓、多數(shù)散在排列，革蘭陰性短桿菌。

2.2 生化試驗 發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，對蔗糖的發(fā)酵因菌株而異，產生靛基質，不分解尿素，不產生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，檸檬酸鹽陰性，均符合大腸桿菌的特性。

2.3 血清型的鑒定結果 61株鵝致病性大腸桿菌血清型鑒定結果見表1，各血清型的地區(qū)分布見表2。分離出的61株大腸桿菌，除3株因未出現(xiàn)玻板凝集反應或自凝而未能定型外，其余58株分屬21個血清型。O9、O18、O64、O93共計32株，占全收集52.46%（32／61），11個地區(qū)分離到 O9、O18、O64、O93血清型，占全分離地區(qū)的69%（11／16），這4種血清型在黑龍江省內分布廣泛，為優(yōu)勢血清型。其他分離出的血清型見表1。大腸桿菌的血清型分布比較分散，各地區(qū)分布無明顯規(guī)律性。

表1 61株鵝致病性大腸桿菌分離株的血清型

2.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗結果見表2，表明，分離菌株呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，61株大腸桿菌對氧氟沙星和復達欣高敏比例分別為57%和51%，復方新諾明、先鋒噻肟和氯霉素次之，分別為38%、34%和33%，氨芐青霉素、頭孢呋肟、卡那霉素不足10%，四環(huán)素對所分離的菌株無抑制作用。氨芐青霉素、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率高于66%，因此不建議應用于臨床。大腸桿菌對10種藥物的耐藥率在50%以上，占所檢藥物的56%。耐藥率低于33%的僅有3種，分別是先鋒噻肟，復達欣，菌必治。

3 討論

3.1 鵝致病性大腸桿菌血清型特點 對黑龍江省部分地區(qū)鵝致病性大腸桿菌的血清型鑒定結果表明，鵝場中致病性大腸桿菌的主要血清型是O9、O18、O64、O93共計32株，占全部收集52.46%（32／61），占全部調查區(qū)域的69%，是優(yōu)勢血清型?；旌涎逍?O8／O60，O13／O14，O18／O158，O101／O162在鵝首次分離到。近年來，多種大腸桿菌混合型的出現(xiàn)，在大腸桿菌病的防治上應引起重視。有關致病性大腸桿菌血清型鑒定國內外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型相差比較大。國外有研究報道，禽致病性大腸桿菌常見血清型為 O1、O2、O35、O78［1］，本次試驗則分離出此4個主要血清型。國內血清型多且地區(qū)差異大［2-3］。雖然各地區(qū)血清型有部分交叉，但未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性。本試驗對61株大腸桿菌血清型的鑒定為黑龍江地區(qū)大腸桿菌病的防制提供了參考。優(yōu)勢血清型的出現(xiàn)，為研制有效的疫苗提供了科學的依據(jù)［4］。

3.2 黑龍江省鵝致病性大腸桿菌耐藥譜的變化大腸桿菌易產生耐藥性，可由染色體或質粒介導，它可以通過菌毛將耐藥質粒傳遞給其他大腸桿菌［5］。臨床常用的慶大霉素，氨芐青霉素，氟哌酸對分離的61株鵝致病性大腸桿菌抑菌作用較低，而妥布霉素，四環(huán)素，阿米卡星類對所分離的菌株幾乎無抑制作用。細菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展正是抗菌藥物廣泛應用，特別是無指征濫用的結果。極低的高敏率說明，多數(shù)藥物對大腸桿菌的治療效果一般，同時也易發(fā)生耐藥性的惡化。

表2 61株鵝致病性大腸桿菌對18種抗生素的藥敏

耐藥率低于33%的僅有3種，分別是先鋒噻肟，復達欣，菌必治，以上3種藥物可以作為臨床治療的候選藥物。所以在用藥上，應遵循盡量窄譜的原則，能用窄譜的抗生素就不選用廣譜抗生素，而且要先進行藥敏試驗，后用藥，做到有的放矢，減少無故的耐藥性產生。而且要注意，大腸桿菌用藥一定要量足，因為大腸桿菌的繁殖非?？欤蠹s18min就能繁殖一代，這樣是避免體內藥物濃度不足產生的耐藥性變異。注意進行細菌耐藥性的監(jiān)測，在有限的條件下盡量避免耐藥菌株的產生。多數(shù)菌株多重耐藥嚴重，多重耐藥菌株甚至出現(xiàn)了18耐的情況，13耐、14耐、16耐也不在少數(shù)。所以，交叉用藥的方法也已經不可取了。所以，針對大腸桿菌耐藥性的解決應是以后的重點。

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